[发明专利]一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针

权利要求书

1.一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸（microRNA）进行半定量检测，其特征在于：所述的可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针具有一种由人工创造的非天然空间结构，命名为“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”，这是一种新型的核苷酸空间结构，由两个核苷酸相邻的二级结构组成，这种空间结构在特定条件下通过与靶序列的特异性结合，引起探针自身的两个二级结构依次变形，变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构，且变形过程不可逆，探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构，而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构。

2.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，其特征在于：所述的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”，由两个相邻的核苷酸二级结构组成，分别是“多功能茎环结构”和“单侧3’悬端双螺旋结构”，由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短。

3.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，其特征在于：所述的“多功能茎环结构”是一种由普通茎环结构衍生出来的新型茎环结构，由A链按照碱基互补原则单独组装而成，含有三个结构域，分别是外环结构、“占位茎杆结构”和线状单链结构；外环结构是由A链中间区域的与靶序列完全互补核苷酸序列组成，空间结构是一条环状闭合单链，它的功能是与靶序列特异性结合，结合后将导致“占位茎杆结构”被破坏，茎环结构消失；“占位茎杆结构”是由A链近5’端的核苷酸序列和与外环结构3’端方向最后一个核苷酸相邻的核苷酸序列为起点，按照碱基互补原则形成的双螺旋结构，“占位茎杆结构”的近5’端的核苷酸占领了下游待结合B链的近3’端的结合位点，导致B链与A链结合后，B链的3’端无位点结合，成为3’悬端，它的功能不仅是维持茎环结构，增强外环结构对靶序列的识别能力，还是形成“单侧3’悬端双螺旋结构”的必需结构；线状单链结构由A链近3’端核苷酸序列形成，是按照碱基互补原则设计成的B链互补序列，空间构象是线状单链，它的功能是固定B链在探针中的位置。

4.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，其特征在于：所述的“单侧3’悬端双螺旋结构”是一种受“多功能茎环结构”调控的单侧3’端核苷酸游离的双螺旋结构，由A链的“占位茎杆结构”、线状单链结构和B链共同组成，B链一级结构的3’端核苷酸结合位点与A链一级结构近5’端核苷酸的结合位点重合，结合在A链的线状单链结构区，若“多功能茎环结构”完整，则“单侧3’悬端双螺旋结构”存在，若“多功能茎环结构”被破坏，则“单侧3’悬端双螺旋结构”将变形为普通双螺旋结构。

5.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，其特征在于：所述的这种空间结构在特定条件下通过与靶序列的特异性结合，是指在常规核酸杂交缓冲液中，杂交温度在50-65 ℃之间，能够触发核苷酸二级结构发生变形，使探针从初始“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的唯一条件，这个唯一条件是探针的“多功能茎环结构”中的外环结构与靶序列发生特异性结合。

6.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，其特征在于：所述的引起探针自身的两个二级结构依次变形，探针自身的两个二级结构依次变形的顺序，核苷酸二级结构变形起始于“多功能茎环结构”的外环结构与靶序列的特异性结合，二者结合形成的双螺旋导致“占位茎杆结构”这个双螺旋被打开，在“多功能茎环结构”消失的同时暴露了原本由“占位茎杆结构”占领的B链3’端核苷酸结合位点，引起“单侧3’悬端双螺旋结构”的3’悬端与结合位点结合，变为普通的双螺旋结构，整个变形过程不可逆。