[发明专利]一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针

说明书

技术领域

本发明涉及医学和分子生物学技术领域中的一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针。

背景技术

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的核糖核酸（RNA），在细胞发育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理过程中发挥重要作用。研究发现，人的体液中如血液、尿液、唾液、羊水、胸腹水等广泛存在microRNA，这些microRNA的表达谱与在组织细胞中一样，在肿瘤等病理状态下会发生特征性的改变，这些特定的microRNA表达谱是肿瘤细胞特异性生物标志物之一，是一种新的无创伤性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。传统的microRNA检测方法包括印迹杂交技术（Northern Blotting），以及反转录与实时定量聚合酶链式反应（realtime PCR）联合应用，这些方法比较成熟且广为使用，但是存在着过程繁琐、价格昂贵、耗时较长、灵敏度低、易出现假阳性结果等缺陷，日益无法满足当前的检测需要。因此，研究开发一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针一直是急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，该发明用于对体外细胞培养、离体组织、血液等样本提取的总microRNA中的某一种microRNA的进行半定量检测,利用探针进行microRNA的半定量检测，无需反转录及任何扩增技术，只需将少量样本直接加入反应体系中，50-65 ℃恒温5-30分钟，检测荧光强度即可，荧光强度累积速率与目的基因浓度成正比。

本发明的目的是这样实现的：一种可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针，用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸（microRNA）进行半定量检测，所述的可直接对微小核糖核酸（microRNA）进行半定量的探针具有一种由人工创造的非天然空间结构，命名为“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”，这是一种新型的核苷酸空间结构，由两个核苷酸相邻的二级结构组成，这种空间结构在特定条件下通过与靶序列的特异性结合，引起探针自身的两个二级结构依次变形，变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构，且变形过程不可逆，探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构，而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构；

所述的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”，由两个相邻的核苷酸二级结构组成，分别是“多功能茎环结构”和“单侧3’悬端双螺旋结构”，由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成，A链较长，B链较短；

所述的“多功能茎环结构”是一种由普通茎环结构衍生出来的新型茎环结构，由A链按照碱基互补原则单独组装而成，含有三个结构域，分别是外环结构、“占位茎杆结构”和线状单链结构；外环结构是由A链中间区域的与靶序列完全互补核苷酸序列组成，空间结构是一条环状闭合单链，它的功能是与靶序列特异性结合，结合后将导致“占位茎杆结构”被破坏，茎环结构消失；“占位茎杆结构”是由A链近5’端的核苷酸序列和与外环结构3’端方向最后一个核苷酸相邻的核苷酸序列为起点，按照碱基互补原则形成的双螺旋结构，“占位茎杆结构”的近5’端的核苷酸占领了下游待结合B链的近3’端的结合位点，导致B链与A链结合后，B链的3’端无位点结合，成为3’悬端，它的功能不仅是维持茎环结构，增强外环结构对靶序列的识别能力，还是形成“单侧3’悬端双螺旋结构”的必需结构；线状单链结构由A链近3’端核苷酸序列形成，是按照碱基互补原则设计成的B链互补序列，空间构象是线状单链，它的功能是固定B链在探针中的位置；

所述的“单侧3’悬端双螺旋结构”是一种受“多功能茎环结构”调控的单侧3’端核苷酸游离的双螺旋结构，由A链的“占位茎杆结构”、线状单链结构和B链共同组成，B链一级结构的3’端核苷酸结合位点与A链一级结构近5’端核苷酸的结合位点重合，结合在A链的线状单链结构区，若“多功能茎环结构”完整，则“单侧3’悬端双螺旋结构”存在，若“多功能茎环结构”被破坏，则“单侧3’悬端双螺旋结构”将变形为普通双螺旋结构；