[发明专利]一种木聚糖酶突变体及其制备方法和应用

说明书

一种高催化效率且耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法和应用，涉及基因工程和遗传工程领域。本发明以来源于丝状真菌Bispora sp.MEY‑1的GH10家族木聚糖酶XYL10C为母本，采用分子生物学技术将母本中第175位的E位点进行饱和突变，结果发现，突变体XYL10C‑CutN、E175H、E175N、E175D、E175V、E175L、E175Q、E175M八个突变体的催化效率和比活较野生酶有大幅度提高，通过饱和突变发现研究该点在XYL10C高比活和高催化效率中所扮演的重要角色，此方法对木聚糖酶酶及其它(α/β)8桶状酶的高效催化机制的研究具有重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种高催化效率且耐高温木聚糖酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

纤维素、半纤维素和木质素是构成植物细胞壁的主要成分，约占了世界上50％生物量。半纤维素主要存在于细胞壁的表面，纤维素包裹在半纤维素中，而半纤维素又与木质素共价连接形成网状结构。木聚糖是半纤维素的主要成分，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源，几乎占地球有机碳含量的三分之一。木聚糖的结构复杂，其主链是由吡喃木糖以β-D-1,4-木糖苷键连接起来，并带有多种取代基。

由于木聚糖的多样性和结构的复杂性，它的完全水解需要多种酶的协同作用才能完成。包括木聚糖酶、木糖苷酶以及水解侧链取代基团的α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶等。通过这些酶的协同作用，木聚糖能够有效地被水解。其中，木聚糖酶能够降解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，是木聚糖降解过程中发挥最重要作用的酶。木聚糖酶在饲料工业、食品工业、造纸工业以及能源、纺织、医药等行业均具有广泛的应用价值。

木聚糖酶的分子改良方面主要集中在热稳定性机理研究及改良。Ding等(2013)通过分子动力学模拟的方法研究来源于Streptomyces lividans的木聚糖酶Sl-XlnA的热不稳定性区段，确定影响Sl-XlnA热稳定性的因素。Gallardo等通过强制进化的方法使来源于Paenibaciius barcinonensis的木聚糖酶Xyn10B的热稳定性提高20倍。Kamondi等通过family shuffling的方法，将两个10家族的木聚糖酶进行随机片段的替换，发现有4个杂合体的最适温度得到了提高。但在第10家族木聚糖酶其它性质的机制及改良方面的研究还很少，尤其在第10家族木聚糖酶高效催化机制及改良方面的研究还未见报道。

发明内容

本发明的一个目的是对材料XYL10C截掉N端序列后获得的木聚糖酶以及材料XYL10C中E175位点突变后获得的木聚糖酶突变体的氨基酸序列进行保护，并详细研究N端序列以及E175位点在XYL10C的高催化效率中所扮演的角色。

本发明的再一目的是提供包含E175饱和突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含E175饱和突变体基因的重组菌株。

野生型氨基酸序列全长如SEQ ID NO.1所示。

MSFHSLLISGLLASVAVAVPKEAWGITVTETKTVSTTIIATVTELGTCSSTITSPTSDATTTTTSSATNTNPTTTLLATPQPSNWGLNNAARADGKLWFGTAADIPGLEQDDRYYMKEYNNTHDFGGTTPANIMKFMFTEPEQNVFNFTGAQEFLDIAFASHKLVRCHNLIWQSELPTWVTNPTTNWTNETLSKVLQNHVYTLVSHFGDQCYSWDVVNEALSDDPAGSYQNNIWFDTIGPEYVAMAFEYAEKAVKDHKLNVKLYYNDYNIEYPGPKSTAAQNIVKELKARNIQIDGVGLESHFIAGETPSQATQITNMADFTSLDIDVAVTELDVRLYLPPNATSEAQQVADYYATVAACAATERCIGITVWDFDDT YSWVPSTFAGQGYADLFFQPDGPNTPLVKKAAYDGCLQALQHKAESP