[发明专利]一种基因缺失突变的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细胞处理及连续培养

培养两皿A_L细胞至对数生长期分为对照组和处理组，即一皿不做任何处理，另一皿用1-4μg/mL亚砷酸钠连续处理12-48小时，再将对照组和处理组A_L细胞各以(2.0-5.0)×10⁵/ml细胞密度重新种植到培养皿中，连续培养6-8天；

(2)细胞收集

收取对照组和处理组A_L细胞，酶解消化，悬浮于F12完全培养基中，清洗后各制成浓度为±10⁶细胞/100μl的单细胞悬液；

(3)与荧光抗体的结合

加入80-120μl预冷的流式细胞缓冲液重悬细胞后，加入荧光标记的CD59特异性抗体，3-5℃避光反应30-60分钟后，再用预冷的流式细胞缓冲液清洗离心，去除未结合的抗体；

(4)制备上样悬液

重悬步骤(3)中所得的两组A_L细胞于预冷的流式细胞缓冲液后，获取上样悬液；

(5)细胞分选

将制备得到的上样悬液送入流式细胞分选仪中，使用流式细胞微孔板分选技术进行单细胞分选；

(6)细胞扩增和图谱分析

将分选获得的单细胞突变子进行连续培养，扩增后对其突变图谱进行分析。

2.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中A_L细胞包括野生型A_L细胞、由野生型A_L细胞发展的各种缺陷型细胞以及构建的细胞系。

3.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶解消化所用的为胰蛋白酶，为质量含量为0.25％的胰蛋白酶和0.02％EDTA溶于PBS缓冲液制得。

4.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中荧光抗体的添加量为：相对±10⁶细胞/100μl的单细胞悬液，每100μl加入10-20μl荧光抗体。

5.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)中使用流式细胞微孔板分选技术进行单细胞分选的具体步骤如下：

a、建立前向散射FSC/侧向散射SSC散点图，通过初步设定门P1，排除死细胞和细胞碎片，找到目标细胞群；

b、建立SSC-W/FSC-W散点图，通过二次设定门P2，排除双联体细胞；

c、建立PE-A/FSC-A荧光分析点图，根据对照细胞群位置设定阴阳性界定门，界定门以下为阴性CD59^﹣细胞群，界定门以上为阳性CD59^﹢细胞群。

d、对阴性CD59^﹣细胞群区域进一步精确设门，利用流式细胞微孔板分选技术对精确设门区进行单细胞分选。

6.根据权利要求5所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)中根据界定门分选获得的两类细胞群用于连续培养或作为流式检测CD59基因突变技术中的阳性CD59^﹢和阴性CD59^﹣对照细胞。

7.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)中使用流式细胞微孔板分选技术进行单细胞分选时，使用的微孔板为流式细胞分选仪系统限定的多孔细胞培养平板。

8.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)中利用流式细胞微孔板分选技术进行单细胞分选时，可进行多板孔板的连续分选，最终所获的A_L细胞为不同类型和程度突变引发CD59^﹣表型的单细胞。

9.根据权利要求1所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤(6)中突变图谱分析方法为：对每个单细胞突变子克隆11号染色体上与CD59基因物理图谱位置接近的APO-A1、CAT、WT9、PTH和RAS五个标记基因进行多重PCR扩增，分析各突变细胞的突变图谱，进一步鉴定CD59基因突变的类型和突变程度。

10.根据权利要求1-9任一所述的基因缺失突变的高通量筛选方法，其特征在于，所述单细胞突变子的前期扩增培养采用条件培养基，获取方法为：待正常野生型A_L细胞长满至培养皿底65-75％时收集其培养基，经3500-4500rpm离心15-25min，0.22μm无菌微孔滤器过滤除去杂质、细胞碎片后分装冻存，培养单细胞突变子时在新鲜F12完全培养基中加入45-55％的上述培养基即为条件培养基；所述流式细胞缓冲液采用的配方为：质量比为1％的牛血清白蛋白，10mM叠氮钠溶解于磷酸盐缓冲液PBS，pH＝7.0。