[发明专利]一种基因缺失突变的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物细胞突变检测筛选技术领域，尤其涉及一种基因缺失突变的高通量筛选方法。

背景技术

目前癌症已被公认为是全球范围内严重危害人类健康的头号杀手。而环境污染物通过诱导基因突变，导致遗传物质的不可逆损伤对癌症的发生是必需的。因此对环境污染物的遗传毒性尤其是其致突性的客观评价对于人类癌症的早期预警具有重要指导意义。近年来，A_L细胞已被广泛用于环境污染物如石棉、有机污染物、重金属、辐射、纳米材料等的致突性及相关机理研究。A_L细胞是中国仓鼠CHO细胞gly^-A突变株与正常人成纤维细胞杂交后所得永生化细胞，含有一整套中国仓鼠CHO-K1染色体和一条人的11号染色体。而11号染色体包含多个癌基因和抑癌基因,其突变与人类多种常见高发性癌症有关。人的11号染色体可编码多种细胞表面蛋白，其中包括CD59基因(旧称为MIC1基因)编码的CD59细胞表面抗原(旧称为S1抗原)。传统的A_L细胞基因突变检测和筛选技术原理为：野生型A_L细胞CD59基因正常表达时在细胞表面形成CD59抗原，在兔血清补体存在的情况下，该抗原与特异性抗体E7.1结合后，导致野生型细胞裂解而无法生存；突变细胞因不能表达CD59蛋白，无法与抗体和补体作用而得以存活，在培养皿上形成一个个肉眼可见的突变细胞克隆群。克隆数目越多，则说明污染物的致突性越强。为了进一步研究环境污染物致CD59基因突变的类型和大小，该技术又利用位于人11号染色体长臂或短臂上的5个标记基因(WT、PTH、CAT、RAS以及APO-A1)引物对突变细胞克隆的突变图谱进行了分析。这5个基因的物理图谱位置与CD59基因接近，并且编码区有可用的PCR引物。由于A_L细胞中仅含有一条人的11号染色体，突变细胞中这5个基因PCR产物对应条带的出现与否意味着在CD59基因缺失基础上，含有该基因的特定DNA片段的存在或缺失，从而可根据缺失基因物理图距判断基因缺失突变的程度。该技术主要包含以下步骤：

1)将处理后细胞制成单细胞悬液，以合适的密度重新种植到细胞培养皿中(处理组细胞须根据细胞存活率增大接种量)，连续培养7天，使处理后的存活细胞有足够的时间从生长暂时停滞状态中恢复，同时，也使突变细胞繁殖的后代细胞表面不再残留CD59抗原；

2)收集细胞，将5×10⁴细胞接种于含有2ml F12完全培养液的60mm培养皿中；CO₂培养箱中孵育2小时待细胞贴壁后，加入新融化的0.2％抗体和1.5％(体积百分比)补体；每次实验都设有同批对照组，包括抗体单独处理组、补体单独处理组、空白对照等；

3)连续培养细胞10天左右，直至形成肉眼可见的单细胞克隆；

4)在无菌条件下，利用特制的克隆环圈定单克隆，在胰蛋白酶的酶解作用下，收集单克隆中所含的细胞。为了确保所分析的细胞是来自独立单细胞克隆，每个培养皿中仅分离一个，偶尔至多两个完全分开的单细胞克隆；

5)将分离的悬浮细胞移至培养皿中，连续培养，直至获得所需的细胞数目；

6)提取以上所获突变细胞DNA，利用聚合酶链式反应(PCR)对WT、PTH、CAT、RAS以及APO-A1等5个标记基因进行扩增；

7)取10μl扩增产物用3％琼脂糖凝胶电泳分析拍照，并根据标记基因条带的有无绘制遗传突变图谱进行对比分析。

该实验体系虽较成熟，且其检测灵敏度也比HGPRT实验和细菌的Ames实验高出许多，但仍存在一些弊端，比如前期突变实验操作繁琐，且需考虑补体自身对细胞的杀伤力；后期突变细胞克隆培养需10-12天，周期长，且不同突变程度的细胞表型一致，均形成类似的克隆群而不易区分；该方法受培养皿面积和种植细胞数目限制，仅能获得有限的单突变细胞克隆群；挑取单细胞克隆过程很容易造成不同单克隆之间的污染，对实验操作人员的技术要求非常高，而为了确保所分析的细胞是来自独立单细胞克隆，每个培养皿中仅分离一个或两个单细胞克隆，这又极大增加了工作量；传统实验中的兔血清补体价格昂贵，抗体制备成本高，且抗体补体用量较多，细胞培养皿等器材耗费较多等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，在流式细胞微孔板分选技术的基础上，结合特异性荧光抗体，提供了一种快速、准确的基因缺失突变的高通量筛选方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种基因缺失突变的高通量筛选方法，包括如下步骤：

(1)细胞处理及连续培养