[发明专利]一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法

权利要求书

1.一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失hly基因。

2.根据权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，其特征在于：所述的基因敲除减毒单增李斯特菌的保藏编号为：CCTCC M 2016523。

3.一种疫苗，其特征在于：含有权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。

4.一种抗体，其特征在于：由权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。

5.权利要求1所述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)分别使用hly 5′F、hly 5′R、hly 3′F和hly 3′R引物以EGD-e基因组为模板扩增hly基因的上游片段P1/P2、下游片段P3/P4；

2)得到的PCR片段电泳后割胶回收，使用酶Xbal I对片段进行单酶切，并电泳割胶回收，产物使用T4 DNA连接酶连接，得到的上下游连接产物与pMD19-T Vector连接并转化至DH5α感受态细胞中，得到的菌悬液涂布于含100μL/mL Amp平板上，37℃培养，挑取单菌落扩大培养后进行PCR鉴定，对应的阳性克隆菌液使用质粒抽提试剂盒抽提质粒；

3)将连有同源臂的pMD19-T Vector与pKSV7质粒使用相同的限制性内切酶SmaI和SalI进行双酶切，产物使用T4 DNA连接酶连接并导入Lm感受态细胞，将阳性克隆的质粒抽提后进行SmaI和SalI限制性内切酶双酶切，获得hly基因缺失的Lm减毒菌株。