[发明专利]一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物学领域，涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌，具体来说是一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法。

背景技术：

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种营细胞内寄生的人畜共患的食源性致病菌，广泛存在于生鲜或即食食品中。Lm可穿透人体的三大屏障——肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障，导致肠炎、脑膜炎、流产，因此是研究胞内寄生菌与宿主之间的相互作用的重要模式菌。在寄生及繁殖的不同阶段中，Lm有多个毒力因子来协助其进行机体的感染继而发挥致病作用，目前已发现多个与Lm致病性与毒力相关因子其中多是表面蛋白或者是分泌蛋白。编码这些蛋白的毒力基因(hly，plcA，plcB，mpl，actA，inlA和inlB)主要位于细菌染色体上的两个毒力岛上。其中hly基因编码的溶菌素(Listeriolysion O，LLO)是一个主要毒力因子。

LLO是一种由529个氨基酸组成具有溶血活性的成孔蛋白，属胆固醇依赖性溶细胞素家族的成员。它在Lm从初级和次级吞噬体逃逸中以及在宿主细胞质中的增殖中都起到关键的作用。基于hly基因在Lm致病性中起到的重要作用，构建Lm的hly缺失减毒菌株不仅对于研究开发Lm减毒疫苗研究等有重要意义。而且，对于研究LLO在细胞内囊泡逃逸过程及其在Lm在细胞与细胞间的感染机理具有一定指导意义。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法，所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌及其制备方法要解决现有技术中的没有合适的单核细胞增生李斯特氏菌用于减毒疫苗的技术问题。

本发明提供了一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌，所述的这种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌缺失hly基因。

进一步的，所述的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为：CCTCC M 2016523。

本发明还提供了一种疫苗，含有上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌。

本发明还提供了一种抗体，由上述的一种基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌免疫产生。

本发明还提供了上述基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的制备方法，包括如下步骤：

1)分别使用hly 5′F、hly 5′R、hly 3′F和hly 3′R引物以EGD-e基因组为模板扩增hly基因的上游片段P1/P2、下游片段P3/P4；

2)得到的PCR片段电泳后割胶回收，使用酶Xbal I对片段进行单酶切，并电泳割胶回收，产物使用T4 DNA连接酶连接，得到的上下游连接产物与pMD19-T Vector连接并转化至DH5α感受态细胞中，得到的菌悬液涂布于含100μL/mL Amp平板上，37℃培养，挑取单菌落扩大培养后进行PCR鉴定，对应的阳性克隆菌液使用质粒抽提试剂盒抽提质粒；

3)将连有同源臂的pMD19-T Vector与pKSV7质粒使用相同的限制性内切酶SmaI和SalI进行双酶切，产物使用T4 DNA连接酶连接并导入Lm感受态细胞，将阳性克隆的质粒抽提后进行SmaI和SalI限制性内切酶双酶切，获得hly基因缺失的Lm减毒菌株。

本发明在构建单核细胞增生李斯特氏菌减毒菌株菌株的过程中，首先利用同源重组技术对标准菌株EGD-e进行减毒得到李斯特减毒菌株EGD-e△hly。然后并从生长状态、溶血、毒力基因转录水平、宿主致死率等方面研究hly基因缺失菌株的生物特性，为食源性致病菌LM致病机理研究提供基础。

上述构建的基因敲除减毒单核细胞增生李斯特氏菌的保藏编号为：CCTCC NO:M 2016523；菌株名称为：单核细胞增生李斯特氏菌EGD-e(hly基因缺失)Listeria monocytogenes EGD-e(hly基因缺失)，保藏日期：2016年9月26日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国武汉武汉大学，邮编：430072。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明构建的hly基因缺失菌株生长速率与EGD-e无差异；hly基因缺失后，该缺失菌株与EGD-e有显著性差异，溶血性降低。hly基因敲除还导致inlC和prfA基因转录水平的下调，基因plcB，vip的上调。同时，通过实验证明，hly基因敲除后的突变菌株毒性下降。

附图说明

图1显示了EGD-e△hly的构建原理。