[发明专利]菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法及应用

说明书

本发明公开了菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法，包括酶解、超滤、强阳离子交换柱色谱分离、凝胶柱色谱分离等步骤，且公开了上述制备方法得到的菲律宾蛤仔抗肿瘤肽在抑制A549非小肺癌上的应用。本发明采用最佳酶解与纯化工艺制备菲律宾蛤仔抗肿瘤肽，超滤获得分子量小于5 KDa的组分并经两步分离纯化，获取得到高活性多肽，整体工艺简单，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及水产加工利用技术领域，尤其是涉及一种菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的制备方法及应用。

背景技术

生物活性肽是蛋白序列内不活动的特定蛋白质片段，这个特定蛋白质片段可通过胃肠消化或食品加工从亲本蛋白中释放出来，并表现出多种生物功能活性，在机体生命活动中起着重要作用。生物活性肽是由两个或两个以上氨基酸缩合而成的，一般具有2～20个氨基酸残基，分子量一般小于6KDa。生物活性肽的结构特性(氨基酸组成及序列)影响活性肽的活性，使得生物活性肽表现出多种生物活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抑菌和抗凝血等。我国海洋贝类种类丰富，产量居世界之首，2014年产量达1 341.67×104t。海洋贝类肉质肥嫩，鲜美可口，含有大量的蛋白质、氨基酸、多糖等营养物质，是一种经济价值极高的海洋生物。大多数情况下，海洋贝类仅仅被加工成食品，品种单一，产品附加值低。运用酶解技术从海洋贝类或其加工副产物中提取具有生物功能活性的多肽，高值化利用海洋贝类资源，可获得更好的经济效益。近年来，从海洋贝类中获取生物活性肽的研究受到了广泛关注。

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)，俗称杂色蛤，广泛分布于我国沿海地区，是我国四大养殖贝类之一，富含蛋白质、脂肪、多糖和人体必需的微量元素，是一种经济价值极高的海洋贝类。已有研究表明，菲律宾蛤仔提取物具有多种生物活性。近年来有关菲律宾蛤仔提取物的研究主要集中于抗氧化、增强免疫力和降血压等方面，而对抗肿瘤的研究较少。我所于2016年10月公开了“利用酶法制备菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的研究”(《渔业现代化》第43卷第5期)，通过研究采用酶解技术获取菲律宾蛤仔多肽，获取得到的多肽产物仅在体外对A549的抑制率高，但是纯度及活性不高，而只有活性的肽才能对人体体内产生很好的效果，因此有必要进行进一步的研究开发，提高菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的制备方法，以获取高活性多肽。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.酶解，取新鲜菲律宾蛤仔，海水吐沙后，放入冰箱冷冻后，开壳取肉，匀浆，料液比1:1，调节pH值2.0，添加胃蛋白酶，加酶量为500～3000U/g，酶解温度31～43℃，酶解时间2～12h，灭酶后离心，取上层清液；

S2.超滤，将步骤S1得到的上层清液进行超滤截留，收集分子量5KDa以下的截留液，纳滤浓缩脱盐，冷冻干燥；

S3.强阳离子交换柱色谱分离，步骤S2中冷冻干燥的产物通过强阳离子交换柱，缓冲液线性洗脱后，在紫外-可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥；将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥；

S4.凝胶柱色谱分离，将步骤S3中冷冻干燥后的产物过凝胶柱洗脱，然后在紫外-可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥，将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥即得菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽。

其中，步骤S3中采用SP Sephadex C-25强阳离子交换柱，缓冲液为含浓度小于等于1mol/L NaCl的乙酸纳-乙酸缓冲液进行线性洗脱，洗脱速度为0.5～1.5mL/min。