[发明专利]重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法

权利要求书

1.重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：

①、制备标准品溶液；

所述标准品溶液制备方法为：将rhIL-1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B₂稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B₂是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液；所述rhIL-1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL-1β的比活性≥1×10⁷U/mg；

②、制备供试品溶液；

所述供试品溶液是由以下方法制成：取rhIL-1ra滴眼液，加培养液B₂，至rhIL-1ra浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B₂是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液；

所述rhIL-1ra滴眼液是由以下方法制成：rhIL-1ra50mg、人血白蛋白1g、甘露醇60g、氯化钠70g、氯化钾2g、磷酸氢二钠14.4g、磷酸二氢钾2.4g，加水，配制成1000ml的溶液；

③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为6×10⁴个/ml～7×10⁴个/ml；

所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；所述的盐酸含HCl为36％～38％；

将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：

式中，

P_r为标准品的生物学活性，U/ml；

D_s为供试品预稀释倍数；

D_r为标准品预稀释倍数；

E_s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

E_r为标准品半效量的稀释倍数。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述A375-s2细胞悬液的细胞浓度为7×10⁴个/ml。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述A375-s2细胞悬液是由以下方法制成：取对数生长期的A375-s2细胞，胰蛋白酶消化计数后，用培养液A调细胞浓度为7×10⁴个/ml；所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：步骤③中，所述噻唑蓝溶液是由以下方法制成：取噻唑蓝0.1g，加PBS溶解并稀释至20ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，即得。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述PBS是由以下方法制成：取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌，即得。