[发明专利]重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法

说明书

本发明公开了重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、测定吸光度，记录测定结果，试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，计算供试品的生物学活性。本发明提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。

技术领域

本发明属于生物药物活性的检测领域，具体涉及重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法。

背景技术

IL-1ra能与IL-1在T淋巴细胞上的受体竞争性结合，从而抑制IL-1的生物学活性，根据这一原理建立了IL-1ra生物学活性的多种检测方法：IL-1ra抑制IL-1诱导的小鼠胸腺细胞增生实验；IL-1ra抑制IL-1诱导的人皮成纤维细胞分泌PGE₂实验及抑制其他T淋巴细胞株如D10AG4.1和D10(N₄)增殖的实验。

但以上方法存在有很多不足之处，如PGE₂的检测步骤较多；小鼠胸腺细胞法由于活体个体差异，使结果很不稳定；其他T淋巴细胞除对IL-1有增殖作用外，对其他细胞因子同样有作用，特异性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。

本发明提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：

①、制备标准品溶液；

②、制备供试品溶液；

③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375-s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；

所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5ml Triton X-100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；

将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：

式中，

P_r为标准品的生物学活性，U/ml；

D_s为供试品预稀释倍数；

D_r为标准品预稀释倍数；

E_s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

E_r为标准品半效量的稀释倍数。

进一步的，步骤①中，所述标准品溶液是由以下方法制成：将rhIL-1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B₂稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B₂是培养液A加入rhIL-1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液。

进一步的，所述rhIL-1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL-1β的比活性≥1×10⁷U/mg。