[发明专利]测定槲皮素与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法

权利要求书

1.一种测定槲皮素与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法，包括以下步骤：

1)对洁净的传感芯片进行表面羧基化修饰；

2)筛选用于溶解目标蛋白的缓冲液的pH值；

3)对传感芯片表面修饰的羧基进行活化；

4)将目标蛋白溶解于步骤2)选定pH的缓冲液中，使之流经步骤3)活化的芯片表面，将目标蛋白共价结合到芯片上；

5)配制槲皮素浓度为c₁、c₂、…、c_i的系列溶液，其中i为自然数；

6)按浓度由稀至浓的顺序将步骤5)配制的槲皮素溶液送入表面等离子体共振仪中，通过步骤4)处理后的传感芯片，记录每一个浓度为c_i的槲皮素溶液进样且信号稳定后的信号值R_i，同时，记录不含有槲皮素但其他成分相同的对照溶液进样且信号稳定后的信号值r_i；

7)数据分析：计算各个1/c_i和1/(R_i-r_i)，并以1/(R_i-r_i)对1/c_i作图，1/c_i为横坐标，1/(R_i-r_i)为纵坐标；对图中数据点进行线性拟合，所得方程的截距记为b，斜率记为a，则结合反应的平衡常数为b/a，单位为实验中所用浓度单位的倒数。

2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，在步骤1)中，所述传感芯片为镀金玻璃片，使用由浓氨水、30％过氧化氢、水按体积比1:1:5混合而成的溶液进行清洁，然后以水洗净并干燥。

3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，在步骤1)对芯片进行表面羧基化修饰的方法是将芯片安装入表面等离子体共振仪，然后使用满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为一种巯基取代的直链羧酸，其中巯基位于碳链远离羧基的另一个末端，碳链长度为含有三至二十碳原子，溶质浓度为2mmol/L至50mmol/L，溶剂为水和/或乙醇；流通过程中实时监测SPR信号，流通时间从进样后直到SPR信号不再变化为止，但至少为1分钟，溶液流速为0.1微升/分钟至1毫升/分钟。

4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，在步骤2)比较不同pH的蛋白溶液流经羧基修饰的芯片时SPR信号的变化：若在所尝试的几个pH值中，所使用的流通时间下，各溶液均使SPR信号达到稳定，则选择稳定后信号与基线相差最大的溶液的pH；若在使用的流通时间下各溶液均未使信号达到稳定，则选择信号变化最快的溶液的pH；若部分达到稳定部分未达稳定，则选择流通完成时刻信号与基线相差最大的溶液的pH。

5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤3)采用下述方法I或II对芯片表面修饰的羧基进行活化：

方法I：使满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，两者浓度均为0.0001至0.5克/毫升，且前者浓度不低于后者浓度，流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，流通时间以SPR信号不再变化为准，但至少为1分钟，芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值；

方法II：先后使N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基丁二酰亚胺溶液分别流通经过芯片表面，各自浓度为0.0001至0.5克/毫升，流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，流通时间均以各自的SPR信号不再变化为准，但各自均至少为1分钟，芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。

6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤4)将目标蛋白用pH为4至5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，钠离子浓度不高于50mmol/L，目标蛋白浓度为1纳克/毫升至50毫克/毫升之间，使之流通经过芯片表面，芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值，流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，流通时间以SPR信号不再变化为准，但至少为1分钟。