[发明专利]测定槲皮素与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学中表面等离子体共振技术的应用方法，具体涉及一种用于测定槲皮素与蛋白质相互作用结合水平的表面等离子体共振分析方法。

背景技术

表面等离子体共振法，简称为SPR(surface plasmon resonance)，是一种广泛用于分析、检测物质的分子间相互作用的分析方法，能够用于大分子、小分子、离子间相互作用的研究。SPR的基本原理为先在合适的条件下利用入射光照射SPR传感芯片，激发入射光在入射点产生的倏逝波与与传感芯片表面金属薄层的表面等离子波的共振，使得出射光强减弱；此后使相互作用过程在传感芯片表面发生，导致溶液性质的改变，引起共振条件的变化，进而出射光性质发生变化，即可实现对相互作用反应的监测。在一个典型的SPR实验中，参与相互作用反应的一个反应物往往被通过共价键、静电作用、疏水作用等方式结合到SPR的检测芯片表面，分析时使另一个(或几个)反应参与物的溶液流动通过该检测芯片表面。当发生相互作用反应时，检测芯片的表面和表面附近溶液的性质发生改变，最终产生仪器信号的响应。SPR特别适用于测定相互作用反应的速率常数、平衡常数等物理化学数据，可以不需标记地实时、快速对非稳定平衡的体系进行测定。

槲皮素(quercetin)又名栎精或槲皮黄素，是黄酮类物质中的一种，其结构式如下：

槲皮素是芦丁等多种其他黄酮类物质糖甙结构中的甙元，具有多种生理药理活性。它具有抗氧化活性，能够被用于抗衰老作用；它能够显著抑制离体癌细胞的生长，可以作为抗癌药物组分；它能够抑制血小板聚集和抑制5-羟色胺释放的效果，因而在心脑血管疾病的治疗中也存在应用。当作为药物使用时，槲皮素进入人体后需要通过与多种蛋白质发生相互作用以实现其生理、药理功能，例如，槲皮素在体内的输运依赖于它与血液中的人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的可逆结合以，其功效发挥也和其与受体蛋白的可逆结合有关。因此，研究槲皮素与蛋白质相互作用的有关过程，特别是求得其与多种蛋白质发生结合反应的平衡常数，往往是其药理、代谢等研究的基础数据。

SPR法是一种适合用于分析分子间相互作用的方法，特别适合于蛋白-槲皮素间的快速实时分析。但是槲皮素几乎不溶于水而易溶于有机溶剂，故SPR对槲皮素的分析存在困难。SPR分析过程依赖将被分析物溶液流经传感芯片时产生的信号，其信号强度取决于传感芯片表面附近(约50纳米内)被测物的质量的大小，因此当被分析物是槲皮素等小分子物质时，它必须在水环境中有足够大的溶解度，以形成足够强的信号。此外，SPR分析过程往往使用含有无机盐的缓冲溶液来制备样品溶液以模拟生物体内生理环境，这进一步加剧了槲皮素溶解度低的问题。目前专利方法中并无使用SPR法研究槲皮素与蛋白质相互作用方法的报道，原因即为槲皮素在水溶液中溶解度问题。因此，有必要通过分析步骤的改进，提高槲皮素在水环境中的溶解度，并进一步开发基于SPR的槲皮素-蛋白质相互作用结合水平的快速分析测定方法。

发明内容

为了弥补现有方法的不足，本发明的目的是提供一种基于表面等离子体共振原理的新型相互作用分析方法，通过在溶剂中添加有机溶剂以改善槲皮素的溶解度，实现对槲皮素和蛋白质相互作用结合水平(即结合反应的平衡常数)的测定。

本发明基于表面等离子体共振(SPR)技术的分析方法包括传感芯片的清洁、芯片表面的羧基化修饰、蛋白质溶液pH的筛选、芯片表面羧基的活化、蛋白质的共价结合、槲皮素的溶解与稀释、蛋白质与槲皮素相互作用过程的测定、数据分析等步骤。具体过程如下，各步骤须依次进行。

1、传感芯片的清洁。

当SPR传感芯片(通常为镀金玻璃片)为可拆卸式结构时，将传感芯片整体浸没于由浓氨水、30％过氧化氢、水按体积比1:1:5混合而成的溶液中，并置于60-95℃环境中至少10分钟，然后以水清洗，干燥后使用。当传感芯片为不可拆卸式结构(即金属层直接镀于棱镜表面)时，在芯片表面检测窗口位置滴加上述溶液，并置于低于90℃但尽可能高(不损坏棱镜等结构)的温度下至少30分钟，然后以水洗净表面并干燥后使用。也可以使用全新传感芯片。

优选的，每次分析流程均使用全新传感芯片，为镀有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成后弃去。

2、芯片表面的羧基化修饰。