[发明专利]一种Cas9/RNA系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体是一种Cas9/RNA系统及其应用。

背景技术

由于化石燃料的不可再生，以及燃烧化石燃料释放的CO₂造成的温室效应的影响，发展可靠，环境友好，经济可行的替代能源已经成为我国以及世界的一项重要的任务。生物燃油是一种对现用汽油的极具吸引力的替代品。现在的可再生液体燃料主要用食物为原料进行生产的。现在的生物燃料包括从油脂农作物(例如：大豆、棕榈树、动物脂肪、地沟油)中提取的生物柴油、生物乙醇和其它的提取自甘蔗和谷类的醇类、H₂、长链的烃和沼气(Scott et al.,2010)。生产以农作物为来源的生物燃料需要大量的可耕种土地，这会和种植可食用农作物竞争土地，导致了一个“食物vs燃料”的矛盾。最近，高产油微藻被认为是一种可以生产用于运输的高质量汽油的有前途的可再生原料(Beer et al.,2009；Chisti,2007)。

理想的微藻生物燃料藻株应该可以快速生长，高生物量，高油脂含量，容易收集，抗病性强。虽然已知的微藻种类多余500,000，但是直到现在，也仅有有限的几种微藻被认为是潜在的生物能源生产藻株，但是没有被认为是理想的。为获得经济可行的工业生物能源微藻，对微藻的驯化和基因工程改造是必须的。

基因工程是了解和改造微藻油脂生物合成过程中关键的工具。随机插入(Rochaix and van Dillewijn,1982)，同源重组(Nelson and Lefebvre,1995)，RNAi(Schroda et al.,1999)，锌指核酸内切酶(Schroda et al.,1999)，TALEN技术(Daboussi et al.,2014)等已经被运用到了微藻的基因工程改造。CRISPR/Cas9系统是最近在细菌和古细菌中发现的一种RNA介导的控制病毒入侵和消除质粒的适应性免疫系统。从2013年起，Cas9/gRNA系统已经被广泛的应用于特定的基因组改造中。Cas9/gRNA系统仅需要对RNA进行替换便可对新的基因位点进行敲除，因此，与锌指核酸酶和TALENs技术相比，Cas9/gRNA系统更容易被编辑。此外，Cas9/gRNA系统还可以通过对基因组双链的打断提高同源重组效率，但未见在宿主体内可以持续表达Cas9/gRNA，并对宿主进行传代连续敲除的报道。

同时，近几年对于被归类为眼点藻纲，不等鞭毛门(不等鞭毛们还包含褐藻和硅藻)的海洋微拟球藻(Nannochloropsis sp.)的研究逐步提升，不等鞭毛们还包含褐藻和硅藻。而这种藻株的油脂组成和油脂含量都已经被研究过(Danielewicz et al.,2011；Schneider and Roessler,1994；Sukenik and Carmeli,1990；Tonon et al.,2002)。此外，微拟球藻在不同条件下的生长状态在最近几年被迅速研究(Hu and Gao,2003；Rodolfi et al.,2009；Srinivas and Ochs,2012；Xu et al.,2004)。而且，Nannochloropsis oceanica(Pidkowich et al.,2007；Wang et al.,2014)和Nannochloropsis gaditana(Radakovits et al.,2012)的基因组已经被几个研究小组测序，而且在世界范围内，微拟球藻已经变成了研究基于CO₂的油脂生产的新的模式藻株。

但是，采用Cas9/gRNA系统对藻株进行基因改造并未有相关报道，因此其具有潜在经济意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种Cas9/RNA系统及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种Cas9/RNA系统，Cas9/RNA系统为筛选标记、Cas9蛋白基因和RNA的编码DNA；其中，Cas9蛋白基因为：编码与RNA结合并对目的基因进行敲除的蛋白质基因；RNA的编码DNA为能够指导Cas9蛋白进行基因切割的RNA的编码DNA。

一种Cas9/RNA系统，其特征在于：Cas9/RNA系统为筛选标记、Cas9蛋白基因和RNA的编码DNA；其中，Cas9蛋白基因为：编码与RNA结合并对目的基因进行敲除的蛋白质基因；RNA的编码DNA为能够指导Cas9蛋白进行基因切割的RNA的编码DNA，所述Cas9/RNA的核苷酸序列如SEQ NO:2所示。

所述筛选标记的抗性基因为潮霉素抗性基Hyg等敏感基因。