[发明专利]一种快速检测褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性的方法

说明书

本发明基于环介导恒温扩增技术(LAMP)建立一种褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性的快速检测方法，属于抗药性综合治理和褐飞虱综合防治范畴。该检测方法通过在褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗性靶标变异个体(A302S)的γ‑氨基丁酸受体(GABA receptor)上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂的抗性个体。其特征在于如下步骤实现：提取单头褐飞虱2‑3龄若虫基因组DNA；所使用的特异性引物；LAMP反应体系；LAMP反应程序；扩增产物的颜色检测。该方法稳定性高、周期短、灵敏度高，适合褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗性的早期检测。

技术领域本发明建立了一种基于环介导恒温扩增技术(LAMP)快速检测褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性的方法，属于生物方法领域，用于褐飞虱对作用于昆虫γ-氨基丁酸受体(GABA receptor)的杀虫剂(包括氟虫腈、乙虫腈和丁烯氟虫腈)抗性靶标变异(A302S)的高灵敏、快速分子检测。

背景技术我国是世界上农林生物灾害发生最严重的国家之一，生物灾害发生频繁，为害严重，损失巨大。我国常见农作物有害生物有1000多种，其中可造成严重危害的近100种，年发生面积达70亿亩次。如蝗虫、稻飞虱、稻纵卷叶螟、小麦条锈病、稻瘟病的暴发频率较高，对农业生产威胁很大，每年经过大力防治，挽回粮食损失1800亿斤左右，但仍损失粮食近500亿斤，防控任务十分繁重。有害生物抗药性快速增长，目前至少有30种农作物害虫对40种杀虫剂、20多种病原菌对各类现代选择性杀菌剂产生了不同程度的抗药性。病虫抗药性的暴发往往导致防治失败，如果补救防治不及时或不到位，将造成严重的经济损失，抗药性的产生同时导致更多的化学农药投入田间，对环境造成严重污染，对有益生物造成毁灭性的杀伤。我国每年因使用农药引起的中毒人数超过9万人；发生作物药害的面积约300万亩。由于化学农药过度和不当使用，不仅造成严重的生态环境污染(高达80％的农药漂移或流失到非靶标生物、土壤和水域中)，而且成为农产品质量安全的隐患。农药残留和重金属污染超标是当前农产品质量安全的突出问题，已经成为国际市场对我国农产品设置绿色贸易壁垒的主要依据。

水稻是我国第一大粮食作物，常年播种面积4.77亿亩左右，占粮食播种面积的30％，总产量约2亿吨，产量占粮食总产的40％左右。水稻主要害虫，褐飞虱、二化螟等，成为威胁水稻产量的主要因素之一，全国农作物病虫测报网监测调查和专家会商分析，2017年农作物病虫害呈重发趋势，预计发生面积比上年增加9.7％，稻飞虱在长江流域及其以南大部稻区偏重或大发生，发生面积比上年增加27.5％，发生面积13.9亿亩次，其中，虫害发生面积9.5亿亩次，病害发生面积4.4亿亩次；抗药性的上升及由此导致的大量化学农药的使用，同时威胁着水稻品质和农业生产安全。随着2005-2006年褐飞虱对吡虫啉高抗性的产生，氟虫腈随着大量应用；由于氟虫腈对于蜜蜂及水生生物具有较高毒性，我国从2009年10月1日起已禁用，基于氟虫腈基础上开发的新型农药丁烯氟虫腈投入使用，丁烯氟虫腈在我国目前在螟虫的防治上登记使用，王鹏在2011-2012年监测褐飞虱对丁烯氟虫腈的抗药性，结果表明，我国8省(市)的18个褐飞虱种群中，对丁烯氟虫腈的抗性倍数为1.0-7.3倍，为敏感-低水平抗性，与往年监测结果无明显差异。

环介导恒温扩增反应(LAMP)是日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围30-80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于昆虫突变基因型的快速鉴定及检测。