[发明专利]稳定表达抗TNF-α单克隆抗体细胞表达体系

权利要求书

1.一种稳定表达抗TNF-α单克隆抗体细胞表达体系的构建方法，其步骤如下：

1）、重组质粒pcDNA3.1-LC-IRES-HC的构建

通过人工合成方法合成得到抗TNF-α单克隆抗体轻链LC、内部核糖体进入位点IRES及抗体重链HC基因串联的LC-IERS-HC基因，在两端分别引入酶切位点，经酶切、连接后插入到pcDNA3.1载体上，从而构建重组质粒pcDNA3.1-LC-IRES-HC；所述LC、HC和IRES基因序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；

2）、以BAK1基因为靶标的抗TNFα人鼠嵌合单克隆抗体同源重组载体的构建，步骤如下：

(1)在重组质粒pcDNA3.1-LC-IRES-HC构建的基础上，经BglII和BstZ17I双酶切并回收得到两个片段，分别为片段1和片段2；

(2)在Bak1靶点序列的上下游各选取一段序列作为同源重组质粒的同源模板，经过PCR扩增得到两个片段，分别为同源臂1和同源臂2；引物分别含有片段1和片段2的同源序列，

引物信息如下：

同源臂1上游引物： GCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGGACTTGGGGTTCGTATCCCAGGTC，

同源臂1下游引物：GAGAGTGCACCATAGGGGATCGGGACCCCCTGGGTCTCTTGTTCCTGATG，

产物长度921bp；

同源臂2上游引物：ATCAATGTATCTTATCATGTCTGTAGGGAGGGGGACTGGACTTATCTCTG，

同源臂2下游引物：AAGCTCTAGCTAGAGGTCGACGGTAGGGTGTGGTTTGAAAGTGTGAACCC，

产物长度792bp；

PCR反应条件如下：

同源臂1的PCR扩增反应条件为：94℃ 3min；94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min；72℃10min；30个循环；

同源臂2的PCR扩增反应条件为：94℃，3min；94℃ 45s,60℃ 45s, 72℃ 1min；72℃10min；30个循环；

(3)将片段1、片段2、同源臂1、同源臂2进行同源重组，得到以BAK1基因为靶标的抗TNFα人鼠嵌合单克隆抗体同源重组载体；

3）、以Bak1基因为靶标的CRISPR/Cas9载体的构建，步骤如下：通过人工合成方法，合成针对靶基因的sgRNA基因，并通过酶切Bbs1连入氨苄抗性的pX330-Case9质粒中得到靶向切割靶基因的CRISPR/Cas9质粒；

4）、抗TNF-α单克隆抗体的CHO细胞表达体系的建立，步骤如下：

(1)采用碱裂解法提取质粒；

(2)转染，将同源重组质粒与CRISPR/Cas9质粒共转；

(3)G418方法筛选稳定细胞系；

并且，

①转染24小时后，按比例稀释接种到10cm培养板上，加最佳筛选浓度培养基，每隔一天换一次液；

②培养6天左右细胞大量死亡时，培养基中增加血清浓度；

③培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力；

④筛选12-14天左右时有抗性克隆出现；

⑤提取基因组，进行PCR检测目的基因是否整合到基因组上；提取总RNA，RT-PCR检测目的基因是否转录；

⑥验证目的基因已经整合到基因组上并转录后，应用有限稀释法筛选阳性克隆，将单克隆转入96孔板培养，达到1个细胞/孔；

⑦单克隆鉴定：挑出1个细胞/孔的孔，做好标记，后面ELISA只检测这些孔中的细胞；细胞扩增后，ELISA检测目的基因是否表达并确定表达量；

⑧根据ELISA测定蛋白表达量的结果，挑选表达量高的单克隆转移到六孔板中扩大培养，此时使用筛选培养基；

⑨待细胞汇集度达到80-90％时，细胞传代到10cm培养皿中，此时使用筛选培养基，待细胞汇集度达到80-90％时冻存。