[发明专利]稳定表达抗TNF-α单克隆抗体细胞表达体系

说明书

本发明涉及一种稳定表达抗TNF‑α单克隆抗体的细胞表达体系及构建方法和应用，依照细胞密码子偏爱性将抗TNF‑α单克隆抗体的轻、重链编码基因进行优化，构建了以Bak1基因等做为靶标的抗TNFα人鼠嵌合单克隆抗体同源重组载体，同时针对Bak1等靶标基因外显子区域构建具有特异性切割作用的CRISPR/Case9载体，釆用脂质体转染的方式将两种载体共同导入中华仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞，筛选获得稳定表达抗TNF‑α单克隆抗体的阳性细胞株。本发明可用于抗TNF‑α单克隆抗体的高效生产，该抗体可用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗。

技术领域

本发明属于生物医药领域，是一种稳定表达抗TNF-α单克隆抗体细胞表达 体系的构建及表达。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种原因不明的慢性全身免 疫性炎症疾病，可引起全身的关节肿胀疼痛及功能障碍，是主要的致残性疾病之 一，严重影响患者的生活质量。RA是一种世界范围的常见病，我国的患病率为 0.3-0.4％，任何年龄均可发病，多见于30-50岁的女性。

目前治疗RA的药物主要包括非甾体类抗炎药(Nonsteroidal antiinflammatorydrugs，NSAIDs)、改善病情抗风湿药(Disease-modifying anti-rheumatic drugs，NMARDs)、肾上腺皮质激素、中药制剂及生物制剂等，由于RA的病因复杂，涉 及细胞因子及免疫等作用，化学药物及中药制剂的治疗均对靶点缺乏针对性，而 随着生物技术的飞速发展，特异性针对细胞因子作用的单克隆抗体等生物制剂已 成为目前针对性最强，疗效最好的RA治疗药物，被视为根治RA的希望。其中， 抗TNF-α单克隆抗体infliximab(商品名REMICADE)是已在美国广泛应用的RA 一线治疗药物，疗效显著、起效快、药效持久。但该药物在国内的生产尚属空白， 临床全部依赖于进口，治疗成本高昂。

另外，目前市售的抗TNF-α单克隆抗体是将轻链和重链通过两个质粒进行 共表达，遗传稳定性相对较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，通过在重链和轻链基因序列中 间引入一个内部核糖体结合位点(IRES)，成功实现了轻链和重链双顺反独立共 表达。同时，利用CRISPR-Cas9技术，将抗TNFα单克隆抗体基因稳定的定点整 合在宿主细胞的基因组中，在实现抗体稳定高效表达的同时灭活对细胞增殖及抗 体表达生产具有潜在负面影响的基因，从而提升生产效能。

本发明的技术方案如下：

一种稳定表达抗TNF-α单克隆抗体细胞株，依照细胞密码子偏爱性优化的 轻链、重链编码基因进行密码子，构建轻链、重链共表达的真核表达质粒，利用 CRISPR-Cas9技术实现抗体基因在宿主基因组的稳定定点整合，获得稳定表达抗 TNF-α单克隆抗体的阳性细胞株。

而且，所述宿主细胞包括CHO、NS0、SP2/0，CHO细胞包括CHO-K1、CHO-S。

一种稳定表达抗TNF-α单克隆抗体细胞表达体系的构建方法，以不影响细 胞基本存活能力、而对细胞增殖及抗体表达生产具有潜在负面影响的基因为靶标， 构建特异性整合到靶基因位点的抗TNFα人鼠嵌合单克隆抗体同源重组质粒以 及特异性切割靶基因的CRISPR/Case9载体，通过将二者共同转染到宿主细胞中， 经筛选成功获得稳定定点整合的抗TNF-α单克隆抗体LC与HC多顺反共表达细 胞系。

而且，所述负面影响的基因包括Bak1、Bax、Igfbp4、AqpI。

而且，所述抗体同源重组表达质粒是将轻链LC和重链HC以多顺反子形式通 过内部核糖体结合位点IRES串联在一起，从而实现独立共表达。

而且，构建方法如下：