[发明专利]一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法

说明书

本发明公开了一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，步骤如下：1)取猴头菌发酵菌丝体，采用高纯度乙醇提取，过滤，减压浓缩回收乙醇，再经石油醚和乙酸乙酯萃取得粗提物；2)以氯仿、二氯甲烷、甲醇和水体积比4:2:3:2的混合液作为两相溶剂体系，静置分层后上相作为固定相，下相作为流动相；经高速逆流色谱分离后得到黄酮类化合物。本方法简便，重现性好，可用于化合物的大量制备，为进一步活性研究提供奠定了物质基础。

技术领域

本发明涉及一种黄酮类化合物分离纯化的方法，尤其涉及一种高速逆流色谱分离纯化高纯度猴头菌中黄酮类化合物的方法。

背景技术

猴头菌(Hericium erinaceus)属于菌物界猴菇属。其成熟的子实体和通过发酵产生的菌丝体均可作为中药的原料,性质平和稳定、味道甘甜可口。其主要成分为吡喃酮、甾体、生物碱、芳香类、二萜类化合物，具有抗肿瘤，修复神经组织等作用。

现代研究表明黄酮类化合物，具有有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种生理功能及药理作用，其提取物可以运用于食品、药品、化妆品等产品中。金雀异黄酮，具有抑制结肠癌、皮肤癌、前列腺癌，预防骨质疏松等作用。是一种很有潜力的癌症化学预防剂，其抗癌作用及机制具有广泛的应用前景。

目前天然产物的分离主要采用柱色谱进行分离，该方法容易造成环境污染，耗时较长，所需试剂量较大，容易对样品形成不可逆吸附作用。高速逆流色谱(High-speedcountercurrent chromatography，HSCCC) 是近年来发展起来的一种高效连续的液-液分配技术，由于不使用固相载体作为固定相，被分离的物质在互不相容的两相分配分离，克服了固相载体带来的样品的吸附、损失、污染等问题，具有分离量大、回收率高、节约溶剂等特点，被广泛的应用于天然产物活性成分制备分离。

发明内容

本发明的目的在于采用高速逆流色谱方法从猴头菌中分离黄酮化合物的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案；

一种应用高速逆流色谱分离猴头菌中黄酮类化合物的方法，所述方法步骤如下：

A、猴头菌发酵菌丝体粗提物的制备：

取猴头菌发酵菌丝体，用乙醇或乙醇水溶液为提取剂提取，收集提取液，过滤，减压浓缩回收乙醇，得到乙醇提取物；将乙醇提取物依次通过石油醚萃取取石油醚层，再以乙酸乙酯萃取取乙酸乙酯层，蒸馏挥去溶剂干燥后得到猴头菌发酵菌丝体粗提物；

B.高速逆流色谱法分离：

以氯仿、二氯甲烷、甲醇和水的混合液作为两相溶剂体系，充分混合后静置分层，两相分离后超声脱气，上相作为固定相，下相作为流动相；将固定相充满高速逆流色谱仪的色谱柱，设定高速逆流色谱仪，在900～1000r/min转速下，水浴温度为15～25℃的条件下，以 2～3ml/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，用上相、下相体积比为1:1的混合溶剂溶解猴头菌发酵菌丝体粗提物，制备得样品溶液进样，以波长为254nm的紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱的峰形收集流出液，将收集到的流出液用高效液相色谱进行检测，将出峰及保留时间相同的流出液合并，浓缩后冷冻干燥，得到目标产物黄酮类化合物。

进一步，本发明所述的乙醇水溶液中乙醇质量浓度为90～95％。

进一步，本发明所述两相溶剂体系中氯仿：二氯甲烷：甲醇：水的体积比为4～6:2～4:3～5:2～3。

更进一步，本发明所述两相溶剂体系中氯仿：二氯甲烷：甲醇：水的体积比优选为4:2:3:2。

进一步，本发明所述黄酮类化合物具体为金雀异黄酮，结构式如下：