[发明专利]一种人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法

权利要求书

1.一种人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法，其特征在于，由如下步骤组成：(1)FIV-1沉淀的溶解：将低温乙醇-Cohn法分离血浆蛋白工艺产生的FIV-1蛋白沉淀溶解于pH7.5-8.0、20mM Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，搅拌5h，温度范围为20-35℃，待蛋白充分溶解完，过滤，取滤液备用；(2)阴离子交换层析：取阴离子交换填料凝胶悬浮液，室温放置达到温度平衡后装柱，用平衡缓冲液平衡5-8个柱体积，将FIV-1沉淀溶解液的滤液pH调至与平衡缓冲液相同，再进行上样，上样体积为1-5个柱体积，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含AAT的洗脱液，层析结束后，用5-8个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，然后用5-8个柱体积的20％乙醇水溶液平衡柱子，整个层析过程在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行；所述阴离子交换层析的填料为DEAE Sepharose High Performance；(3)病毒灭活：将含AAT的阴离子交换层析洗脱液进行冻干，冻干的过程如下：先在空气氛围中-25℃保持2-4h，再-40℃2-4h，然后在真空条件下，-10℃保持30-40h，升温至35℃再保持20-30h，冻干好的样品再于80℃干热病毒灭活72h，干热灭活后的样品再次溶解于水中，加入蔗糖稳定AAT，最终浓度为30-40％，然后加入磷酸三正丁酯和吐温-80进行S/D灭活，最终浓度分别为0.2-0.4％和0.1-0.3％，30℃灭活3-5h后，进行过滤和透析，透析后调节溶液pH与下一步的阳离子交换层析平衡缓冲液的pH相同；(4)阳离子交换层析：取阳离子交换填料凝胶悬浮液，室温放置达到温度平衡后装柱，用平衡缓冲液平衡5-8个柱体积，将病毒灭活后的透析液pH调至与起始平衡缓冲液相同，再进行上样，上样体积为1-5个柱体积，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集AAT的流穿液，层析结束后，用5-8个柱体积的0.5M NaOH清洗柱子，然后用5-8个柱体积的20％乙醇水溶液平衡柱子，整个层析过程在GEExplore 100蛋白纯化仪上进行；所述阳离子交换层析的填料为Macro-Prep High S；(5)超滤、除菌过滤、分装、冻干：将阳离子交换层析的AAT流穿液超滤浓缩，蛋白浓度为10-50mg/ml，之后进行除菌过滤、分装冻干；冻干过程：先在空气氛围中-25℃保持2-4h，再-40℃2-4h，然后在真空条件下，-10℃保持30-40h，升温至35℃再保持20-30h，冻干完成后，即制备出AAT制剂。

2.根据权利要求1所述的人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述阴离子交换层析使用的平衡缓冲液pH为6.5-9.0，平衡缓冲液类型为10-100mMTris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述阳离子交换层析使用的平衡缓冲液pH为4.5-6.0，平衡缓冲液类型为10-100mM柠檬酸或磷酸盐缓冲液。