[发明专利]一种人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种人血浆蛋白α1‑抗胰蛋白酶的分离纯化方法，包括如下步骤：(1)将低温乙醇‑Cohn法分离血浆蛋白工艺产生的FIV‑1蛋白沉淀溶解于缓冲液中，待蛋白充分溶解完，过滤，取滤液备用；(2)滤液经过阴离子交换层析，收集含AAT的洗脱液，所述阴离子交换层析的填料为DEAE Sepharose High Performance；(3)含AAT的洗脱液进行干热灭活和S/D灭活，得到灭活后的含AAT洗脱液；(4)灭活后的含AAT洗脱液经过阳离子交换层析，得到高纯度高活性的AAT穿透液，所述阳离子交换层析的填料为Macro‑Prep High S；(5)AAT穿透液经过超滤浓缩、除菌过滤和分装冻干，即可得到AAT制剂。本发明制备出的α1‑抗胰蛋白酶具有高纯度、高活性、高回收率、步骤简单、重复性好以及易规模化生产的特点，解决了目前其生产工艺中存在的问题。

技术领域

本发明涉及分离纯化技术领域，具体地，涉及一种人血浆蛋白α1-抗胰蛋白酶的分离纯化方法。

背景技术

科技飞速发展的21世纪，血液制品行业已成为生物医药产业的重要组成部分。目前血浆来源的血液制品（血浆蛋白药物）主要有白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、蛋白酶抑制剂四大类，欧美的血液制品企业可以从血浆中获取超过20种的血浆蛋白药物。然而，受人才、技术、临床认知水平等因素制约，国内的血液制品企业最多只能获得7-8种，且主要是基于低温乙醇沉淀工艺分离提纯的产品，包括人血白蛋白、免疫球蛋白和凝血因子Ⅷ产品等。目前国内主要提纯血浆蛋白药物仍基于Cohn等人二十世纪四十年代发明的低温乙醇法，通过调节乙醇浓度、盐浓度、温度和pH，依靠血浆蛋白的溶解度不同来分离，此方法虽然程序简单、溶剂价廉，适用于工业化生产，并能有效保持蛋白的活性，但有较大的局限性，主要可分离血浆中含量较高的蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白），对含量较少的蛋白（如α1-抗胰蛋白酶等）则很难提纯。

α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, AAT)，又称α1-蛋白抑制酶(α1-proteaseinhibitor, α1-PI)。它是人类血浆中最重要的蛋白抑制剂，占血浆总蛋白酶抑制能力的90%以上。它能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶等，其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤，抑制感染和炎症，维持机体内环境的平衡。血浆中的AAT主要是由肝脏合成的单链糖蛋白，肽链由394个氨基酸组成，总含糖量12~14％，它的分子量为～52KD，等电点(PI)为4.7～5.0，正常人血浆中AAT的含量为(2.9±0.45)g/L，在体内的半衰期为3~5天。AAT具有较强的血管通透性，在肺组织中的浓度较高，而且对弹性蛋白酶的专一性更强，因此，AAT的主要功能是抑制肺弹性蛋白酶的活性，使肺部不受弹性蛋白酶的酶解损伤，保护肺部。临床上，AAT制剂可以用来治疗先天或后天性AAT缺乏所致肺气肿、急性肺损伤、囊性纤维化、成人呼吸紧迫综合症等疾病，在临床上具有较高的应用价值。

先天性AAT缺乏症患者15%-25%需要替代治疗，意味着美国约2万人需要治疗，而欧洲至少约4万4至7万3千人需要治疗。替代性治疗病人每周需按60 mg AAT/kg体重进行静脉注射，每年每人需要约208 g AAT。然而用于治疗用的AAT全部是来源于人血浆，来源的限制导致全球AAT供不应求，而且我国还不具备成熟的AAT分离纯化技术。因此，开发AAT分离纯化技术，提高收率、蛋白活性以及纯度显得尤为重要。