[发明专利]禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物及检测体系与应用

权利要求书

1.禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的特异性PCR扩增引物，其特征在于，包括：

正向引物Fg18TF：5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR：5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’；以及

正向巢式外引物HW18TF：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR：5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’。

2.含有权利要求1所述引物的用于检测禾谷镰孢的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.权利要求1所述引物或权利要求2或3所述试剂盒在检测禾谷镰孢中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR进行单轮PCR扩增反应；或者，

当模板DNA浓度过低导致无法扩增出条带时，采用巢式PCR；先利用巢式外引物HW18TF和HW18TR进行第一轮PCR扩增反应，然后取1～2μL扩增产物作为模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR进行第二轮PCR扩增反应；

3)分析PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR反应体系为：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，进行单轮PCR扩增反应以及巢式PCR中第二轮PCR扩增反应，所采用的反应程序为：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min；

巢式PCR中第一轮PCR扩增反应，所采用的反应程序为：94℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，对PCR扩增产物进行1～2％琼脂糖凝胶电泳，如果电泳检测结果出现大小为291bp的特征条带，则表明样品中含有禾谷镰孢。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样品为含有禾谷镰孢的菌丝、分生孢子的样品。

10.禾谷镰孢的特异性PCR检测体系，其特征在于，包括：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反应缓冲液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL；

其中，正向、反向引物的定义同权利要求1所述。