[发明专利]禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物及检测体系与应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的特异性PCR扩增引物及检测体系、含有该引物的试剂盒及其应用。

背景技术

玉米是我国最重要的粮食作物之一，随着食品工业和饲料产业的发展，玉米作为主要食品和饲料作物的地位也日益上升。穗腐病是玉米生产上的重要病害，由多种病原真菌引起，不仅直接造成玉米产量损失，而且籽粒中的致病菌还能够产生多种真菌毒素，如单端孢霉烯、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等，导致玉米品质下降，给食品与饲料带来重大的安全隐患，威胁到人畜健康。

镰孢菌(Fusarium spp.)是玉米生产上常见的病原真菌类群之一，能够在玉米的根、茎、叶、果上引发严重的病害，造成巨大的经济损失。大量研究表明，镰孢菌是引起玉米穗腐病最重要的病原菌，此外，还会引起玉米的茎腐病、鞘腐病、顶腐病、根腐病、苗枯病等病害。主要致病镰孢种包括禾谷镰孢复合种、拟轮枝镰孢、层出镰孢、尖镰孢复合种、黄色镰孢、木贼镰孢等。研究发现，美国、加拿大、德国、奥地利、尼泊尔、巴西、阿根廷等地的玉米穗腐病致病镰孢主要为禾谷镰孢复合种，而加拿大、德国、巴西、阿根廷、法国、意大利、尼罗地亚、尼泊尔、南非、伊朗等地的致病镰孢主要为拟轮枝镰孢，层出镰孢则主要分布在德国、巴西、尼泊尔以及阿根廷西北部。在我国，禾谷镰孢复合种主要分布于山西、陕西、甘肃、云南、贵州、东北及黄淮地区，拟轮枝镰孢主要分布于东北、北京、河北、河南、山东、安徽、四川、湖南、湖北等地，其他致病种也有少量分布。由此可见，禾谷镰孢分布地区较广，是许多地区玉米穗腐病的优势致病菌。

由于镰孢菌在自然界中分布非常广泛，种类多，形态变异大，而传统镰孢菌分离以形态学上差异划分组、种，以不同寄主或不同品种的致病力差异作为专化型或生理小种的鉴定手段，给镰孢菌的识别和鉴定工作带来了一定的困难。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，对于镰孢种属的概念在认识上发生了很大变化，对镰孢菌分类更接近于自然亲缘关系，因此，开发不同镰孢种特异的分子标记，对于准确鉴定镰孢种具有较大的应用价值。

β微管蛋白(β-tubulin)基因广泛存在于真核生物中，目前尚无针对该靶基因设计的特异性禾谷镰孢检测引物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测禾谷镰孢的特异性PCR扩增引物和检测体系以及含有该引物的试剂盒。

本发明的另一目的是提供上述引物及试剂盒在检测禾谷镰孢中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从Fusarium Center's database at Penn State数据库中下载禾谷镰孢(F.graminearum)的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列(KM373925.1)，分析了禾谷镰孢与其他镰孢种在β-tubulin基因序列上的差异(图1)，发现了数个高度特异且只存在于禾谷镰孢中的位点，利用Primer 5软件设计出一系列用于特异检测禾谷镰孢的引物，从中筛选出特异性最强的引物Fg18TF/Fg18TR，并设计了巢式外引物HW18TF/HW18TR来提高灵敏度。在此基础上建立了检测禾谷镰孢的PCR反应体系。

本发明提供的禾谷镰孢特异性PCR扩增引物，包括(Seq ID No:1-4)：

正向引物Fg18TF：5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR：5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’；以及

正向巢式外引物HW18TF：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR：5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’

本发明还提供含有上述PCR引物的用于检测禾谷镰孢的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

本发明还提供上述PCR引物或试剂盒在检测禾谷镰孢中的应用，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR进行单轮PCR扩增反应；或者，