[发明专利]一株利用葡萄糖发酵产β‑丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，致其失活，并将L-天冬氨酸酶编码的基因AspC和L-天冬氨酸-α-脱羧酶PanD的编码的基因共同插入到aceBA基因的位置上，得到大肠杆菌AL12；

将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AL12，即得到利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌AL13。

2.根据权利要求1所述的利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述编码L-天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求1所述的利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的表达质粒为pTrc99a。

5.权利要求1所述的利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；

以SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段3；

以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为引物，线性片段1、线性片段2和线性片段3为模板扩增得到基因敲除片段；

(2)将pKD46质粒转化CGMCC NO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；

(3)将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；

(4)将pCP20转化到步骤(3)得到的阳性重组子中，42℃热激使其表达FLP重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌AL12；

(5)将SEQ ID NO：3所示pncB基因的核苷酸序列克隆至pTrc99a质粒的Nco I和Hind III酶切位点处，得到pTrc99a-pncB重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AL12，即得到利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌大肠杆菌AL13。

6.权利要求1所述的利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌在发酵制备β-丙氨酸中的应用。