[发明专利]一株利用葡萄糖发酵产β‑丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，呈白色棱状结晶或正交双椎体结晶，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β-丙氨酸的生理功能主要是代谢的中间产物，应用极为广泛。医学发现，在哺乳动物神经系统中，它可作为大脑中的神经传递者。在医药方面可作为合成泛酸和辅酶的重要前体物质。在化工方面，可作为一些化学反应的催化剂。β-丙氨酸具有广泛的应用领域和良好的市场前景。

目前β-丙氨酸的生产主要采用的是化学合成法和酶转化法。化学合成法主要是通过丙烯腈法，β-氨基丙腈法以及琥珀酰亚胺讲解法合成β-丙氨酸，这些方法原料、中间体及副产物均有毒，污染环境极为严重。目前国内对酶转化法也已有研究，主要以L-天冬氨酸为原料，采用生物酶法合成，而目前L-天冬氨酸是由富马酸制备而来，富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，β-丙氨酸的制备过程复杂、周期长仍然依赖化石资源。而葡萄糖来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接利用葡萄糖发酵制备β-丙氨酸的生产菌株具有重要的意义，目前尚未有相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为CGMCC NO：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，致其失活，并将L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶所分别编码的基因插入到aceBA基因的位置上，得到大肠杆菌AL12，所述苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA的GenBank登记号为EU889415.1；

将烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB克隆到表达质粒上，得到重组质粒，将该重组质粒转化大肠杆菌AL12，即得到利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌AL13。所述的大肠杆菌CGMCC NO：2301为一株高产富马酸的基因工程菌，该菌株的具体信息在申请号为200810019216.7的专利中已经公开。

烟酸转磷酸核糖激酶是NAD(H)合成系统的限速酶，过量表达pncB能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD⁺，而促进细胞利用葡萄糖生长代谢。通过敲除苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceBA，可阻断乙醛酸循环支路路径，而增强TCA循环路径。经过L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的共表达，使得菌体可直接利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸。

其中，所述L-天冬氨酸酶基因AspC的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，L-天冬氨酸酶基因的GenBank登记号为X03629.1。

其中，L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因panD的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因的GenBank登记号为NC_003450.3。

其中，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，烟酸转磷酸核糖激酶基因pncB的EcoGene登记号为EG10742。

其中，所述的表达质粒为pTrc99a。

上述利用葡萄糖发酵产β-丙氨酸的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列为引物，质粒pIJ773为模板，PCR扩增得到线性片段1；

以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段2；

以SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为引物，SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为模板，PCR扩增得到线性片段3；

以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为引物，线性片段1、线性片段2和线性片段3为模板扩增得到基因敲除片段；

(2)将pKD46质粒转化CGMCC NO：2301菌株，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态；

(3)将步骤(1)中基因敲除片段转化步骤(2)得到的感受态中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子；