[发明专利]一种重组腈水解酶、基因、载体、工程菌及应用

权利要求书

1.一种重组腈水解酶，其特征在于所述重组腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述重组腈水解酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种由权利要求2所述重组腈水解酶编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组腈水解酶在制备亚氨基二乙酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含有重组腈水解酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以湿菌体或湿菌体破碎分离纯化后的纯酶作为催化剂，以亚氨基二乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的50mM磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在25～70℃转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得亚氨基二乙酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物初始浓度为0.02～0.63mol/L，所述湿菌体的用量为10～100g/L，所述纯酶的用量为50-200U/L。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂的制备方法为：

(1)斜面培养：将含有重组腈水解酶编码基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，在28～37℃培养12～24小时，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10-12小时，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7.0；

(3)发酵培养：以体积浓度2％的接种量将种子液接种至含有终浓度50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基进行发酵培养，37℃培养至培养液的OD₆₀₀为0.6-0.8之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.1mM，28℃诱导培养10小时，4℃、5000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体；

(4)分离纯化：将收集的湿菌体在超纯水中重悬，进行超声波破碎，取破碎后的上清液经nickel-NTA柱纯化，上柱之前先用含终浓度300mM NaCl的pH 8.0、20mM NaH₂PO₄缓冲液进行平衡；接着用含终浓度300mM NaCl和终浓度50mM咪唑的pH 8.0、20mM NaH₂PO₄洗脱缓冲液洗脱不具有吸附性的蛋白；最后，用含终浓度300mM NaCl和终浓度500mM咪唑的pH 8.0、20mM NaH₂PO₄蛋白洗脱液解吸目的蛋白，收集蛋白洗脱液洗脱产生的流出液，获得重组腈水解酶纯酶。