[发明专利]一种重组腈水解酶、基因、载体、工程菌及应用

说明书

本发明公开了一种重组腈水解酶、基因、载体、工程菌及在制备亚氨基二乙酸中的应用，所述重组腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种水解亚氨基二乙酸的重组腈水解酶，在催化上述反应时，可以耐受630mM亚氨基二乙腈，比酶活可达159.90U/g，具有良好的底物耐受性和催化活力，生产过程对环境友好；可有效解决传统的化学法水解亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸工艺中，存在的反应条件苛刻，需要消耗大量的有机溶剂，成本较高，收率较低，环境污染较为严重等问题。

(一)技术领域

本发明涉及一种重组腈水解酶、载体及应用，以及利用表达该腈水解酶的重组大肠杆菌进行生物催化亚氨基二乙腈(Iminodiacetonitrile，IDAN)制备亚氨基二乙酸(Iminodiacetic acid，IDA)的方法。

(二)背景技术

腈水解酶是一类功能多样的生物催化剂，可在温和的条件下，通过一步反应催化有机腈类化合物水解得到相应的羧酸和氨。腈水解酶是一类具有广泛底物谱的生物催化剂，具有独特的催化特性，在有机合成中表现出巨大的工业应用潜力。

亚氨基二乙酸，分子式为HN(CH₂COOH)₂，易溶于水，难溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂，是一种重要的化工中间体，广泛用于螯合剂、表面活性剂、农药等的合成，特别是全球性的除草剂草甘膦的中间体的制备。目前，一般采用化学方法进行亚氨基二乙酸的制备，主要包括：氯乙酸法、氯乙酸-氨基乙酸法、氮川三乙酸法、氯乙酸-甘氨酸法、二乙醇胺法和氢氰酸法等。以上化学方法存在生产成本高、污染严重、对设备要求高等不足。生物酶法催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸，具有高效、高选择、反应条件温和、环境污染少、成本低、产物光学纯度高等的优点，符合原子经济学和绿色化学的发展方向，具有化学法无可比拟的优势。

有关以亚氨基二乙腈为底物通过生物酶法生产亚氨基二乙酸的方法已经得到研究，相关的技术得到开发已经有所报道，包括菌株筛选(CN 101629192A)、生物酶法(CN101392276A、CN 102286409 A、CN 102277320 A、CN 102277322 A)和产物亚氨基二乙酸的检测方法(CN 101398413A)。生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的过程如下：

在菌株筛选专利CN 101629192A中报道：取1g湿菌体，置于500mL三角瓶中，加入50mL 2％(w/w)的反应底物亚氨基二乙腈水溶液，30℃摇床150r/min条件下反应60min，筛选到具有催化活性的15株菌，其中粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis ZJB09138)的转化率达54.8％。在生物酶法合成亚氨基二乙酸的专利(CN 101392276A、CN 102286409 A、CN102277320 A、CN 102277322 A)中，分别介绍了四种菌株为粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis ZJUTB10)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus ZJB09131)和节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicusZJUTB0699)。Alcaligenes faecalis ZJUTB10湿细胞为30g/L，在100mL0.2M亚氨基二乙腈的水溶液中，30℃200rpm条件下反应24h后，可得亚氨基二乙酸105.5mM，即产率可达52.8％；Rhodococcus rhodochrous ZJB09125、Micrococcus luteus ZJB09131和Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB0699湿细胞分别为50g/L，在100mL 3％(w/w)亚氨基二乙腈的水溶液(pH 7.0)中，30℃200rpm条件下反应10h后，转化率分别可达26.2％、24.8％和26.5％。在产物亚氨基二乙酸的检测方法(CN 101398413A)专利报道了其色谱条件：Elite C18色谱柱，流动相：甲醇：0.05mol/L乙酸-乙酸钠溶液(甲醇与乙酸-乙酸钠溶液体积比55:45)，流速：1.2mL/min。