[发明专利]一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法

权利要求书

1.一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法，其特征在于，是以人羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞，以人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)作为支架材料，将种子细胞种植于支架材料上构建hAECs-DED组织工程皮肤，包括以下步骤：1)hAECs的分离培养；2)成纤维细胞(FB)的分离培养；3)DED的制备；4)hAECs-DED组织工程皮肤的构建。

2.如权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法，其特征在于，所述hAECs的分离培养具体方法为：将羊膜组织用磷酸盐缓冲液(PBS)反复加以冲洗后剪成细碎小块，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，37℃消化10min，弃消化液；后重复上述方法消化上皮细胞，37℃消化30-40min，200目不锈钢网过滤；收集单细胞悬液，加含10％胎牛血清的培养基终止消化；过滤后组织碎片用同样方法重复消化1次；离心收集的细胞用添加10ng/ml EGF的DMEM完全培养基培养，置于37℃、5％CO₂孵育箱内培养；24h首次换液，后每3天全量换液一次，约10天后细胞可按常规方法传代培养。

3.如权利要求1-2所述的一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法，其特征在于，所述成纤维细胞(FB)的分离培养具体方法为：将表皮组织标本浸入D-Hanks溶液中，4℃保存备用，6个小时内使用；将包皮在无菌条件下用PBS冲洗5遍，用眼科剪剪去皮下组织,将皮肤组织剪成大小约0.5cm×1cm的细长条，放入2.5mg/ml Dispase酶中4℃消化16～18h；次日取出，将表皮与真皮分离；将分离出的真皮组织放入10ml的无菌青霉素瓶中，加入0.2％Ⅳ型胶原酶溶液3ml，37℃消化2～3h，消化后用眼科剪刀将真皮组织剪碎，向瓶中加入含10％FBS的DMEM 3ml终止消化，巴氏吸管吹打数十次，低速离心，弃上清液，用含10％FBS的DMEM培养基1ml重悬，计数板计算，调整细胞密度为2×10⁶/ml，接种于一次性培养瓶中；置5％CO₂、37℃孵箱中培养，24h后首次换液去除未贴壁的细胞，以后2～3天换液1次；7～10天后培养细胞达到70％～80％融合状态时，传代纯化培养，获得成纤维细胞(FB)。

4.如权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法，其特征在于，所述DED的制备方法具体为：取成人皮肤标本常规消毒，加入适量PBS，置于4℃冰箱中备用；制备前用PBS清洗标本数次，常规消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪组织层，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃PBS中30min；用眼科镊去除表皮，将人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)置于Epp管中，迅速置入液氮中约5min，取出后室温放置30min，然后再置入液氮中，连续10个循环；后置于-20℃冰箱中保存备用。