[发明专利]一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程皮肤技术领域，具体是涉及一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法。

背景技术

近年来，各种组织工程皮肤如Apligraf VR、Dermagraft VR等已应用于临床进行创面的修复。现组织工程皮肤的种子细胞大多是同种异体的角质形成细胞，但从诸多方面考虑，角质形成细胞并不是一种理想的种子细胞。为使组织工程皮肤更好的应用于临床，用羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞将是一个更好、更有新意的选择。hAECs较其他细胞更有优势在于它具有向三个胚层分化的可塑性，且它表达生长因子(EGF、KGF、HGF)及抗炎和抗菌的细胞因子，这些有利于创面的愈合。因羊膜是产后废弃物，取材容易，且无伦理学争议。重要的是，hAECs与人类的胚胎干细胞不一样，它不表达端粒酶，故在移植时不会形成肿瘤。因hAECs免疫源性低，因此在移植后发生免疫排斥的风险很低。故hAECs在组织工程皮肤再生中是一个有前景的种子细胞。

除种子细胞外，选择合适的真皮替代物是构建组织工程皮肤的关键。虽然目前大多数的真皮替代物能够模拟真皮的结构和功能，但几乎都缺乏有效的基底膜结构和功能，表皮的角质形成细胞在这种缺乏基底膜的真皮替代物上会逐渐失去增殖能力。为解决这一问题，越来越多的研究者都在寻求一种具备基底膜结构的真皮支架。大量研究表明通过在真皮替代物上添加天然或人工合成的基底膜成分，体外构建的模型中表皮的角质形成细胞的增殖会明显增强，且形成的人工表皮层的功能也有明显的改善。去表皮的真皮组织(DED)是把皮肤组织从基底膜(BM)的透明层处去除表皮而获得的，故在DED的表面保留了大多数的基底膜成分，如层粘蛋白、IV型胶原和VII型胶原等。故具有完整基底膜结构的DED有利于hAECs的分化、复层、角化，使得构建的组织工程皮肤与正常人皮肤更加接近。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法，构建的组织工程皮肤模型中表皮的角质形成细胞的增殖明显增强，且形成的人工表皮层的功能也有明显的改善，为组织工程皮肤的构建提供一种新的更好的选择。

本发明的技术方案是：一种羊膜上皮细胞复合去表皮真皮构建组织工程皮肤的方法，是以人羊膜上皮细胞(hAECs)作为种子细胞，以人去表皮的真皮组织(De-epidermized dermis,DED)作为支架材料，将种子细胞种植于支架材料上构建hAECs-DED组织工程皮肤，包括以下步骤：1)hAECs的分离培养；2)成纤维细胞(FB)的分离培养；3)DED的制备；4)hAECs-DED组织工程皮肤的构建。

进一步地，在上述方案中，所述hAECs的分离培养具体方法为：将羊膜组织用磷酸盐缓冲液(PBS)反复加以冲洗后剪成细碎小块，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，37℃消化10min，弃消化液(主要去除杂细胞和细胞碎片)；后重复上述方法消化上皮细胞，37℃消化30-40min，200目不锈钢网过滤；收集单细胞悬液，加含10％胎牛血清的培养基终止消化；过滤后组织碎片用同样方法重复消化1次；离心收集的细胞用添加10ng/ml EGF的DMEM完全培养基培养，置于37℃、5％CO₂孵育箱内培养；24h首次换液，后每3天全量换液一次，约10天后细胞可按常规方法传代培养；第二代hAEC细胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分别进行Oct-3/4、SSEA-4免疫荧光检测。