[发明专利]一种检测Camv35S启动子的RPA引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一组检测Camv35S启动子的RPA引物，包括：

RPA-35S-F：5'-CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3'；

RPA-35S-R：5'-CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC-3'。

2.检测Camv35S启动子的RPA标记引物组，其由正向引物RPA-35S-F-地和反向引物RPA-35S-R-FITC组成，或由正向引物RPA-35S-F-生和反向引物RPA-35S-R-FITC组成，或由正向引物RPA-35S-F-生和反向引物RPA-35S-R-地组成；

其中，所述正向引物为经生物素或地高辛对权利要求1所述RPA-35S-F引物的5'端标记的标记引物，具体为：

RPA-35S-F-地：

5'-Dig-CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3'；

RPA-35S-F-生：

5'-Biotin-CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3'；

所述反向引物为用FITC或地高辛对权利要求1所述RPA-35S-R引物的5'端标记的标记引物，具体为：

RPA-35S-R-FITC：

5'-6-FAM-CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC-3'；

RPA-35S-R-地：

5'-Dig-CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC-3'。

3.一种检测Camv35S启动子的RPA检测试剂盒，其含有权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA标记引物组。

4.一种检测Camv35S启动子的RPA检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)RPA扩增

以待测样品的DNA作为模板，将权利要求2所述的RPA标记引物组加入到RPA扩增反应体系中，进行RPA扩增，得到双标记的核酸恒温扩增产物；

3)扩增产物检测

将吸附着生物素抗体及异硫氰酸荧光素抗体的核酸检测试纸条插入步骤2)的扩增产物中，侧向层析5～15分钟；

根据显色条带进行判定：试纸条在检测线和对照线处都有紫色条带，则表示待测样品中含有Camv35S启动子；若仅在对照线处有紫色条带，则表示待测样品中不含有Camv35S启动子，若对照线处无紫色条带，则表示无扩增或试纸条无效。

5.根据权利要求4所述检测Camv35S启动子的RPA检测方法，其特征在于，所述的RPA反应体系中，DNA模板的终浓度为0.5～2ng/μl，正向引物和反向引物的终浓度各为0.3～0.6μmol/L。

6.根据权利要求4所述的检测Camv35S启动子的RPA检测方法，其特征在于，所述RPA反应体系总体积为50μl，其中，浓度为10μmol/L的正、反向标记引物各加入2.4μl，浓度为20ng/μl的DNA模板加入2μl，RPA反应缓冲液29.5μl，ddH₂O补足至50μl。

7.根据权利要求4-6任一项所述检测Camv35S启动子的RPA检测方法，其特征在于，步骤2)中，RPA扩增反应程序为：恒温37-39℃，14～20分钟。

8.根据权利要求4-6任一项所述的检测Camv35S启动子的RPA检测方法，其特征在于，步骤2)中，RPA扩增反应程序为：于37-39℃恒温反应4分钟，取出，混合均匀，再扩增15分钟。