[发明专利]一种检测Camv35S启动子的RPA引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因安全生物技术领域，具体涉及一种检测Camv35S启动子的RPA引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

转基因技术快速发展，目前，在我国已经有多个转基因作物品系进入安全评价阶段，申请商业化种植。

与此同时，因转基因作物扩散引起的安全性问题受到了公众的广泛关注。为保护消费者的知情权和选择权，落实转基因产品标识制度、防止转基因作物未经安全批准进入生产流通环节，迫切需要建立快速简便的核酸检测方法，用于市场监管和例行监测。

而在转基因检测中，目前，常规PCR检测方法存在操作繁琐、成本高、单一性等问题，不能适应现代经济的快速发展和频繁的贸易往来。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，与普通PCR不同，其模仿体内复制机理，反应不需要退火过程，整个反应简单快速，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。利用该方法建立的检测技术体系，适合于大规模的转基因植物的检测，可以极大的提高现场检测效率，并为我国在转基因产品的现场速测方面跻身世界前列奠定良好的基础。

RPA方法的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，这是因为，RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基，引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。因此，RPA的引物设计难度较大。探针法的缺点则是探针设计上有难度。另外，探针法在扩增反应完毕后需要用荧光读取仪器才可以完成最后的结果显示。

并且，当前转基因产品的检测显示结果采用电泳法时，需要用到高致癌性的荧光染料溴化乙锭，不仅危害操作人的健康，而且无法排除假阳性的问题，也不能进行田间的现场速测，这严重限制了转基因产品的检测效率，对转基因产品的安全管理是最大的制约。

目前，国际上已经商业化生产的转基因产品中，如水稻、玉米、油菜、大豆等种子产品及以此为基础的深加工食品、制品，很多品系均是采用Camv35S启动子，即P-Camv35S，常规的检测手段需要将被检样品送至实验室进行检测，费时费力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测Camv35S启动子的RPA引物、试剂盒及检测方法，无需探针，利用生物素、地高辛和FITC分别标记RPA正反向引物的5’端，能快速检测被检制品中是否含有转基因成分，具有高度专一性，灵敏度高，检测速度快，直观性强。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一组检测Camv35S启动子的RPA引物，包括：

RPA-35S-F：5'-CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3'；

RPA-35S-R：5'-CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC-3'。

检测Camv35S启动子的RPA标记引物组，其由正向引物RPA-35S-F-地和反向引物RPA-35S-R-FITC组成，或由正向引物RPA-35S-F-生和反向引物RPA-35S-R-FITC组成，或由正向引物RPA-35S-F-生和反向引物RPA-35S-R-地组成；其中，所述正向引物为经生物素或地高辛对RPA引物RPA-35S-F的5'端标记的标记引物，具体为：

RPA-35S-F-地：

5'-Dig-CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3'；

RPA-35S-F-生：

5'-Biotin-CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC-3'；

所述反向引物为用FITC或地高辛对RPA引物RPA-35S-R的5'端标记的标记引物，具体为：

RPA-35S-R-FITC：

5'-6-FAM-CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC-3'；

RPA-35S-R-地：

5'-Dig-CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC-3'。

一种检测Camv35S启动子的RPA检测试剂盒，其含有所述的RPA引物或所述的RPA标记引物组。

一种检测Camv35S启动子的RPA检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)RPA扩增