[发明专利]软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨

权利要求书

1.一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：制备具有如序列表中SEQ ID No.1所示cDNA序列对应的RNA序列的端粒酶mRNA；

步骤二：将所述端粒酶mRNA在完全培养基中转染传代培养的人软骨细胞，所述完全培养基是在DMEM/F12或RPMI1640基础培养基中加入血清、终浓度为5-50μg/ml的维生素C、终浓度为0.01-2μg/ml的B18R或p65i、终浓度为0.1-50ng/ml的雷帕霉素和终浓度为0.1-50μM的白藜芦醇制备得到，所述血清是体积终浓度为1％-20％的人AB血清或体积终浓度为1％-20％的胎牛血清；

步骤三：将转染后的细胞继续使用所述完全培养基进行培养。

2.如权利要求1所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤一中，具体是：

以人基因组DNA或者携带人TERT基因的CDS区序列的质粒作为模板，以序列表中SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示序列作为PCR引物序列进行PCR扩增，或者进行序列全合成，获得如SEQ ID No.4所示的人TERT基因的CDS区序列片段；

在得到的人TERT基因的CDS区序列片段的两端分别连接上如SEQ ID No.5所示的3’UTR和如SEQ ID No.6所示的5’UTR；

在3’UTR后连接上如SEQ ID No.7所示的含poly A的序列，形成DNA片段5’UTR-TERTCDS-3’UTR-含polyA的序列；

将得到的DNA片段进行线性化，然后在体外转录成mRNA；

纯化回收得到所述端粒酶mRNA。

3.如权利要求1所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述人软骨细胞是以用胶原酶消化软骨组织后分离得到的P0代人软骨细胞进行传代培养得到的P3代人软骨细胞。

4.如权利要求3所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，转染时，所述人软骨细胞的密度为40％-70％。

5.如权利要求4所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，转染时，加入的端粒酶mRNA的浓度为0.1-0.2μg/cm³。

6.如权利要求5所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，在所述步骤二中，转染的具体步骤是：转染时先将转染试剂与转染用减血清培养基混合制成混合液A，再将端粒酶mRNA用相应的所述转染用减血清培养基稀释制成B，然后将A和B混合孵育，向P3代人软骨细胞中加入所述完全培养基和上述A与B的混合物，混合均匀培养。

7.如权利要求6所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法，其特征在于，还包括根据人软骨细胞的密度，重复使用步骤二中的转染方法再对转染后培养的人软骨细胞进行一次或多次转染的步骤。

8.一种人源组织工程化再生软骨，其特征在于，包括胶原膜和如权利要求1-7中任一项所述的软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法培养得到的端粒延长的人软骨细胞；所述人软骨细胞贴附在所述胶原膜上。

9.如权利要求8所述的人源组织工程化再生软骨，其特征在于，所述人软骨细胞是以浓度为1×10⁷-4×10⁷个人软骨细胞/ml的细胞悬液按照1×10⁶-4×10⁶个人软骨细胞/cm²的接种密度滴加接种至所述胶原膜上制备得到。

10.如权利要求9所述的人源组织工程化再生软骨，其特征在于，所述细胞悬液中人软骨细胞的存活率控制不低于80％，且在胶原膜上的贴附率不小于80％。