[发明专利]软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨

说明书

本发明公开了一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨。通过在体外对软骨细胞进行端粒酶mRNA转染，使后续培养得到的软骨细胞中端粒延长，并且在端粒酶mRNA的转染与完全培养基中维生素C、B18R或p65i、雷帕霉素和白藜芦醇等小分子化合物的协同作用下，可以显著提高软骨细胞尤其是老龄患者的软骨细胞的增殖与活力，对于改善或治疗衰老引起的细胞功能衰退，使其实际应用于再生医学治疗，具有重大意义。上述软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法使得软骨细胞端粒的延长不是连续的甚至频繁的，无基因组插入诱变风险，也无细胞永生化成瘤风险，在安全性和应用性上有了大大的提高，使之在再生医学治疗上有更好的应用。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其是涉及一种软骨细胞体外端粒延长增殖培养的方法及人源组织工程化再生软骨。

背景技术

端粒是染色体末端的保护帽，其是由短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成的特殊结构，能够保护基因组的稳定性，防止丢失染色体末端的遗传物质。细胞的不断扩增会渐进性地影响端粒的长度。当端粒缩短到一定程度，其保护性将消失，进而引起细胞的老化和凋亡。

端粒酶是合成端粒并保持其长度的酶。端粒酶由两部分组成，一个RNA模板亚单位即端粒酶mRNA组分和一个蛋白催化单位即端粒酶逆转录酶。并非所有的体细胞都有端粒酶。胚胎细胞活跃地表达端粒酶，但是当胚胎细胞分化到一定程度，便停止端粒酶的表达。成体中只有少数细胞被报道有端粒酶表达，比如精原细胞，激活的T细胞和一些干细胞。端粒酶的基因缺陷会造成早老症等疾病，病人会有骨髓衰竭和粘膜疾病等症状，包括异常色素沉积，指甲营养不良，口腔白斑等。有研究证明端粒酶缺失的模型鼠身上重新导入端粒酶后，衰老的症状有被纠正的趋势，包括脑部疾病和不孕等。因端粒与细胞衰老的关系，端粒学说也因此成为氧化应激、糖化、基因等众多衰老学说中的一个，并成为抗衰老研究中的热门课题。

传统的将端粒酶基因导入细胞的DNA重组技术往往涉及到质粒和病毒。Bodar等用含端粒酶基因的载体转染几乎无端粒酶活性的人体细胞，发现端粒明显延长、细胞分离增快、细胞衰老减缓(Bodar(1998)Science.279：349-352)。这种基因工程产品对安全性有很高的要求，包括杂菌、内毒素、质粒等污染物的去除，病毒自我复制能力的测定等，因而限制了其临床使用；其次会造成基因的随机插入，可能会引起基因组的不稳定性；最后，稳定表达端粒酶有造成细胞永生化的风险。这些不利因素影响端粒酶基因疗法的临床使用和市场化。

近年来，导入信使核糖核酸(mRNA)分子让细胞表达基因成为了一种新的基因治疗的手段被研究。由于mRNA直接在细胞质内被作为模板合成蛋白质，mRNA引入细胞后不会整合到基因组中从而影响遗传物质的稳定性。而mRNA作为一种人类自身就拥有的遗传物质，其安全性也比病毒要高。mRNA治疗成为一个研究热门，尤其是作为流感疫苗和肿瘤疫苗被研究。mRNA能够引起长时间的强烈的针对流感病毒的保护性免疫。mRNA作为肿瘤疫苗也已经开展了I/II期临床试验，多数患者产生了针对肿瘤抗原的免疫反应。

随着人们生活质量的提高，越来越多的人加入运动健身的行列，随之而来的问题是运动损伤的患者越来越多，这其中软骨损伤，尤其是膝、踝关节的软骨损伤占很大比例。据国内外文献报道，在膝关节镜检查的人群中，软骨损伤的发病率在61％-68％之间。患者常感觉疼痛、僵硬，最终进展为重度关节炎，甚至无法行走，严重影响生活质量。

由于成熟的软骨组织是无神经，无血管，无淋巴管的组织，并且软骨细胞在软骨组织中分布稀疏，造成软骨组织的自我更新速度缓慢，自身修复能力有限。尤其是老年患者软骨细胞增殖速度和自身修复能力都非常低，大大限制了老年软骨损伤治疗的应用。因此寻求合适的方法，体外增加软骨细胞，尤其是老年患者软骨细胞群体倍增次数，延缓细胞的老化，增加细胞活性，同时避免细胞永生化的可能，是进行软骨修复治疗的难点和重点。

发明内容