[发明专利]一种基于基因敲除细胞的阳性筛选体系的建立方法

权利要求书

1.一种基于基因敲除细胞的阳性筛选体系的建立方法，其特征在于，其包括：

利用CRISPR/Cas9系统在NIH/3T3细胞中对p53基因第六外显子和MAD2基因第一外显子进行定点突变，并将GFP和抗嘌呤霉素基因结合到CRISPR/Cas9系统中，利用嘌呤霉素对转入了CRISPR/Cas9系统的细胞进行筛选，结合荧光显微镜观察GFP荧光步验证嘌呤霉素筛选发生基因敲除的细胞，建立基于基因敲除细胞的阳性筛选体系。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其包括步骤，

1)小鼠p53和MAD2基因修饰靶点sgRNA设计

分别设计用于敲除p53和MAD2基因的20bp的靶点识别序列，将设计的靶点识别序列合成寡核苷酸；

2)制备pCas9-p53-GFP-puro和pCas9-MAD2-GFP-puro质粒

将合成的用于敲除p53和MAD2基因的寡核苷酸分别连接到pCas9-GFP-puro后，转化到大肠杆菌体内，利用大肠杆菌扩增pCas9-p53-GFP-puro和pCas9-MAD2-GFP-puro质粒，并经过测序确认质粒后经试剂盒抽提获得质粒，并测定质粒浓度和纯度；

3)质粒转染和细胞筛选

将pCas9-p53-GFP-puro和pCas9-MAD2-GFP-puro质粒分别转染到NIH/3T3细胞，进行嘌呤霉素筛选和荧光显微镜观察表达GFP细胞情况；

4)p53和MAD2基因敲除分析

提取筛选后的细胞基因组DNA，通过PCR扩增含有基因修饰靶点的片段和T7E1分析基因修饰情况，通过测序确认基因敲除情况。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中，

使用引物p53F(5’ACTTTCTAGCAACCCGTTTG3’)和p53R(5’GACGTCCCTAAGCCCAAGAG3’)扩增含有p53基因第六外显子20bp的靶标序列；引物MAD2F(5’CTTAGGGCTCATTACGCCTG3’)和MAD2R(5’ACACAGACCCCAGCTTTCAG3’)扩增含有MAD2基因第一外显子中20bp的靶标序列。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中，PCR体系和反应条件如下表1所示，

表1

ComponentVolumes2×SurePCRmix210μlForwardprimer1μlReverseprimer1μlDNAsample2μlH₂O6μlTotal20μl

反应条件：95℃3min；95℃1min，57℃1min，72℃1min(38个循环)；72℃7min；4℃保存。

5.按权利要求1所述的基于基因敲除细胞的阳性筛选体系的建立方法，其特征在于，所述的基于基因敲除细胞的阳性筛选体系在用于直接编辑活体小鼠基因组构建小鼠肝癌模型中的用途。