[发明专利]一种基于基因敲除细胞的阳性筛选体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于动物生物技术领域，涉及一种基于基因敲除细胞的阳性筛选体系的建立方法，具体涉及一种对NIH/3T3细胞p53和MAD2基因敲除并对发生基因敲除的细胞进行阳性筛选的体系建立方法。本方法利用建立的系统在NIH/3T3细胞中对p53和MAD2基因进行敲除，并对发生基因敲除的细胞进行阳性筛选。

背景技术

现有技术公开了肝癌已是全球死亡率较高的癌症之一，在男性和女性中，肝癌分别是排名第三和第六的高死亡率癌症，已经严重威胁到人类健康和生命。据统计显示，肝癌患者的5年平均存活率低于11％；全球每年约有700,000新发肝癌患者和近600,000患者死于肝癌；我国是全球肝癌发病率最高和死亡数最多的国家。研究报道，肝癌发生的具体分子机制和通路仍尚未清楚，因此，构建合适的可用于人类肝癌研究的动物模型有助于肝癌的相关研究，目前小鼠已作为实验动物用于人类癌症研究中，小鼠的遗传物质和人非常类似，且构建小鼠模型成本较低、周期较短、基因修饰技术更容易实现。

随着小鼠基因打靶技术和基因编辑技术(ZFN,TALENS,CRISPR/Cas9)的发展，CRISPR/Cas9在操作性、基因编辑效率等方面较ZFN和TALENs有着相对优势。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type II已经被广泛用于基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能够识别20bp的靶向互补序列[29]。Cas9，crRNA和tracrRNA组成复合体，识别并结合crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终导致DNA的双链断裂(DSB)，进而实现基因的敲除和插入。目前，CRISPR/Cas9系统已经可用于对哺乳动物细胞，细菌，斑马鱼，小鼠，猪，猴的基因编辑。构建基因修饰的肝癌小鼠模型方法主要有基于生殖细胞系和活体组织基因编辑方法。研究显示，在活体组织中进行基因编辑的方法可在子一代中实现多基因修饰模型构建，加快造模时间并提高造模效率。

研究公开了MAD2(有丝分裂阻滞缺陷蛋白2)是有丝分裂检查点复合蛋白的重要组成部分，它位于人的4号染色体上；抑癌基因p53参与调节细胞周期进程、DNA修复和细胞凋亡，与细胞的转化和肿瘤的发生有着密切的关系，野生型p53通过调控G1-S检查点和维持G2-M逮捕来保障正常细胞周期进程，进而维持细胞的正常生长，染色体稳定或在多种细胞压力下诱导细胞发生凋亡；在人的肝癌组织中，常见有MAD2和抑癌基因p53的缺失；MAD2的异常表达与癌症有着密切关系，部分缺失MAD2的细胞(MAD2^+/-)伴随着染色体不稳定现象的发生，在小鼠中最终导致肺癌的形成，在小鼠中过表达MAD2同样可导致染色体不稳定、细胞的非整倍性和肿瘤的发生；大量研究表明，染色体不稳定是导致肿瘤发生的主要驱动力之一，此外，在小鼠胚胎成纤维细胞中已证实同时敲除MAD2和抑癌基因p53可以导致染色体极度不稳定的发生。

绿色荧光蛋白(GFP)是由下村修等人于1962年在一种学名为Aequorea victoria的水母中发现，该水母基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，在生物技术领域中，GFP已成功应用于分子标记、药物筛选、融合抗体和生物传感器中；嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞，其作用机制是嘌呤霉素属于氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。因此，有研究采用嘌呤霉素筛选转染携带有pac基因(抗嘌呤霉素)的细胞。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种基于基因敲除细胞的阳性筛选体系的建立方法，利用建立的系统在NIH/3T3细胞中对p53和MAD2基因进行敲除，并对发生基因敲除的细胞进行阳性筛选，进一步用于编辑活体小鼠基因组构建小鼠肝癌模型。

发明内容