[发明专利]一种测定自由巯基含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，涉及一种测定自由巯基含量的方法。

背景技术

自由巯基含量的测定方法有毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法等，也可采用紫外-可见光谱法或者荧光光谱法。然而，毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法，紫外光谱法的灵敏度和准确度比较低，但是这种方法简单、快速，并且反应条件温和，且可以同时测定总的自由巯基而被大家广泛采用。其中Ellman试剂应用最为广泛，中国药典里面收载的蛋白质中自由巯基的含量测定方法即采用该法。但当该方法测定自由巯基的残留时，即测定某种物质中自由巯基的痕量时，该方法就存在灵敏度太低的问题。而在某些反应中，尤其该物质作为起始物料或中间物质时，由于多余自由巯基物质，如二巯基聚乙二醇，二硫苏糖醇等，需要严格控制其残留。

CN102759586A公开了高效液相色谱法测定组合物中巯基化合物含量的方法，在该方法中利用甲酸作为巯基化合物的稳定剂，流动相为含有甲酸的水相与有机相的混合物，可以明显解决或减缓巯基化合物在供试液和流动相中因极端不稳定现象而造成的含量测定误差，然而其并不能提高检测的灵敏度，并不能准确检测残留的痕量自由巯基的含量。

因此，在本领域，急需开发一种高灵敏度，且专属性好的方法来测定样品中的自由巯基含量。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定自由巯基含量的方法，本发明方法具有专属性好，灵敏度高的特点，可以最大限度地免受其他物质信号的干扰，测定结果准确度高，数据可靠。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种测定自由巯基含量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将供试品溶液进样至高效液相色谱仪中进行色谱分离，经过衍生仪时在衍生试剂的作用下进行衍生，由紫外检测器采集液相色谱数据；

(2)利用已知自由巯基浓度的对照品溶液经过与步骤(1)所述供试品溶液相同的处理，得到对照品溶液的液相色谱数据；

(3)通过供试品溶液的液相色谱峰面积与对照品溶液的液相色谱峰面积的比较，计算得到供试品中自由巯基的含量。

在本发明中，通过利用高效液相色谱法并使用衍生剂使得可以大大提高检测的灵敏度，以解决目前测定自由巯基方法中存在的其它物质干扰大，灵敏度差的问题。

优选地，步骤(1)所述供试品为需要测定自由巯基含量的样品。

优选地，所述含有自由巯基的物质为二巯基聚乙二醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸或2-巯基乙醇中的任意一种或至少两种的混合物。

在本发明中，所述含有自由巯基的物质不限于如上列举的具体物质，其他含有自由巯基的化合物或混合物均可以利用本发明的方法实现精确的测定。

利用本发明所述的方法可以完成样品中残留自由巯基的检测，例如本发明可以实现交联玻璃酸钠中二巯基聚乙二醇的残留的定量检测。

在本发明中，所述色谱分离时的流动相可以为一切可以溶解供试品并通过HPLC进行测定的溶剂或溶剂混合物。

优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为醇类、乙腈或水中的任意一种或至少两种的混合物。

优选地，步骤(1)所述色谱分离时的流动相为5％～95％(例如5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)乙腈，优选60-80％的乙腈。

优选地，步骤(1)所述色谱分离时使用的色谱柱为含有长链烷基键合相的色谱柱或其相关色谱柱，优选C18柱；柱温为4～50℃(例如4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃)，优选30～50℃。

优选地，步骤(1)所述色谱分离时样品流速为0.1～5mL/min，例如0.1mL/min、0.3mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1mL/min、1.3mL/min、1.5mL/min、1.8mL/min、2mL/min、2.5mL/min、2.8mL/min、3mL/min、3.5mL/min、4mL/min、4.5mL/min或5mL/min。

优选地，步骤(1)所述衍生剂为5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)的磷酸钠-EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液。