[发明专利]一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用

权利要求书

1.一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

(1)预处理：称取一定重量的脱细胞基质，将其剪成尺寸小于1cm×1cm的小片，在液氮保护条件下粉碎成粉末，粉末尺寸控制在50-300μm；

(2)酶解1：取一定量粉碎后脱细胞基质粉末，加入到脱细胞基质粉末重量500-10000倍的缓冲液，在100℃热处理5-10min，冷却后加入脱细胞基质重量1/200～1/50的胶原酶，于37℃振荡处理2-24h；

(3)酶解2：将步骤(2)获得的溶液pH调节至7.5-8.5，加入非胶原类蛋白酶，非胶原类蛋白酶的加入量为脱细胞基质重量的1/200～1/50，于37℃反应8-24h；

(4)质谱检测：将步骤(3)获得的酶解溶液进行浓缩，浓缩液直接进行质谱分析，以已知浓度的纤维连接蛋白标准品溶液的酶解产物为对照，检测特征多肽，通过测定脱细胞基质降解产物中纤维连接蛋白特征多肽计算脱细胞基质中纤维连接蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)酶解过程中使用的胶原酶是I型、II型、III型、V型或不同类型胶原酶的混合物，加入量是脱细胞基质重量的1/200～1/50。

3.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解过程中使用的蛋白酶是胰蛋白酶，加入量是脱细胞基质重量的1/200～1/50。

4.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解过程中使用的蛋白酶是化学修饰后的胰蛋白酶，加入量是脱细胞基质重量的1/200～1/50。

5.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)酶解过程中使用的蛋白酶是固定化的胰蛋白酶，加入量是脱细胞基质重量的1/200～1/50。

6.根据权利要求1所述的一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中用于检测脱细胞基质中纤维连接蛋白的特征多肽包括：FTQVTPTSLTAQWTAPNVQLTGYR、EINLAPDSSSVVVSGLMVATK、DTLTSR、PAQGVVTTLENVSPPR、VTDATETTITISWR、SYTITGLQPGTDYK、SSPVVIDASTAIDAPSNLR、FLATTPNSLLVSWQPPR、PGSPPR、EVVPR、NNQK或SEPLIGR中的一种或多种。

7.一种纤维连接蛋白的特征多肽，其特征在于，所述纤维连接蛋白经过如权利要求1的步骤(1)、(2)和(3)能够得到所述特征多肽，所述特征多肽能够用于检测所述纤维连接蛋白的含量；所述特征多肽为：FTQVTPTSLTAQWTAPNVQLTGYR、DTLTSR、PGSPPR或EVVPR。

8.一种纤维连接蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法使用如权利要求7所述的特征多肽。

9.一种用于检测纤维连接蛋白的试剂盒，其特征在于，包括一种或多种酶；所述一种或多种酶能够酶解纤维连接蛋白，并产生如权利要求7所述的特征多肽；

所述试剂盒还包括根据权利要求7所述的所述特征多肽的标准品。

10.根据权利要求9中用于检测纤维连接蛋白的试剂盒，其特征在于，所述一种或多种酶包括：胶原酶和蛋白酶；所述胶原酶为I型、II型、III型或V型胶原酶；所述蛋白酶为胰蛋白酶。

11.根据权利要求9中用于检测纤维连接蛋白的试剂盒，其特征在于，所述一种或多种酶包括：胶原酶和蛋白酶；所述胶原酶为I型、II型、III型或V型胶原酶；所述蛋白酶为化学修饰后的胰蛋白酶。