[发明专利]一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用

说明书

本发明提供一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用。所述定量检测方法包括对脱细胞基质的预处理、分步酶解方法和质谱检测过程，通过脱细胞基质的预处理、分步酶解方法获得纤维连接蛋白的所有多肽序列混合物，再筛选纤维连接蛋白中的特征多肽序列，通过质谱法检测特征多肽含量，从而测定出脱细胞基质中纤维连接蛋白含量。该方法解决了以往无法使用质谱法定量检测脱细胞基质中组织型纤维连接蛋白含量的问题；进一步地，通过分步酶解的方式去除脱细胞基质中胶原蛋白成分、减少测试过程非目标蛋白多肽序列的干扰，从而节约了测试时间，提高工作效率、检测精度和稳定性。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质检测方法及其应用，具体地，本发明涉及一种利用质谱技术通过检测特征多肽检测脱细胞基质材料中纤维连接蛋白含量的方法。

技术背景

小肠粘膜下层基质(Small Intestinal Submucosa，SIS)材料是指小肠粘膜下层经脱细胞等方法处理后去除免疫原性物质后的所得到的生物材料，广泛用于各种软组织缺损的修复，具有诱导细胞粘附生长、促进组织再生和重建等功能。SIS材料作为外科植入物已成功用于神经、腹壁、硬脑膜、肌腱、泌尿道、鼓膜等组织缺损的修复，具有安全有效、术后并发症少、感染率低、患者满意度高等优点，证实了SIS材料是一种理想的用于组织缺损修复和重建的无免疫排斥的动物源性植入材料。

SIS基质材料作为一种脱细胞基质主要成分为胶原蛋白，并包含非胶原类的结构蛋白和生物粘多糖。其中胶原蛋白主要由I型和III型组成，非胶原类蛋白主要包括纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)、层粘连蛋白和生长因子等。FN是一种糖蛋白，由两个分子量为220kDa的亚基以二硫键连接的二聚体形式存在，主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、神经胶质细胞和肌细胞等合成分泌，分为血浆型和组织型。通过比较不同物种的FN基因核苷酸序列，结果显示FN基因是高度保守的。不同物种不同组织来源的FN，其分子量、基本空间结构及生物学性质均基本一致。FN作为主要的细胞粘附分子其主要功能是介导细胞粘着、促进细胞与细胞外基质的黏合和增强巨噬细胞的内吞作用，在胚胎生成、伤口愈合和止血等许多重要的生理过程中起着关键性作用，FN的异常表达和降解过程与许多疾病的发生密切相关。SIS中所含有的FN对细胞在SIS表面的粘附与迁移有很大的影响。但是，目前还没有高效、稳定、精确的生物材料中组织型FN的检测方法。

目前已有的FN测定方法包括酶联免疫法(ELISA)、放射免疫法、免疫透射比浊法、单向火箭电泳法、化学发光法、免疫组化法、速率散射比浊法、Micro BCA方法等。其中应用最为普遍的是ELISA法，在ELISA法中首先将FN作为抗原与抗体结合，再经化学显色反应，通过检测显色底物的吸光度值确定FN的含量，但该方法主要用于血浆型FN的检测。SIS中的FN属于组织型并结合形式存在，直接采用ELISA方法则抗体难以直接与FN结合，非特异性吸附也会影响结果的准确度，导致检测结果与实际含量存在较大偏差。

此外，虽然基于质谱的蛋白质检测方法用于低丰度蛋白的定量分析具有灵敏度高、重复性好等优点，可根据蛋白质降解产物中的多肽丰度进行无标记定量检测。但是，作为脱细胞基质成分FN的在脱细胞基质中含量很少，此外由于脱细胞基质的结构使得序列特异性酶难以直接降解这些FN。因此，无法完全酶解脱细胞基质中的FN。可见即使获得一些肽段，也无法作为准确检测FN含量的基础，也就无法使用质谱法定量测量FN在脱细胞基质中的准确含量。

发明内容

针对脱细胞基质中FN检测存在的问题，本发明提供一种基于酶解和质谱分析的纤维连接蛋白的定量检测方法，从而克服上述问题以准确地检测纤维连接蛋白在脱细胞基质中的含量。