[发明专利]一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用

权利要求书

1.一种筛选魏斯氏菌的方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析和/或测序验证，扩增获得与SEQ ID NO,1所示序列存在≥75bp连续相同核苷酸的菌株即为魏斯氏属的菌株。

2.一种筛选魏斯氏菌的方法，其特征在于，根据SEQ ID NO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析，成功扩增出片段大小为120～180bp的菌株即为魏斯氏属的菌株。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物序列包括(1)～(5)中任一对，其中：

(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；

(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；

(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；

(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；

(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将待分离的混合菌在含万古霉素的选择性培养基上培养，获得单菌落进行菌落PCR；所述选择性培养基含有：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉4.0～6.0g/L、酵母粉3.0～5.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、吐温801.0～2.0mL/L、磷酸氢二钾2.0～3.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、柠檬酸三铵2.0～3.0g/L、硫酸镁0.2～0.5g/L、硫酸锰0.05～0.1g/L，L-半胱氨酸0.5～1g/L，那他霉素1.0～1.5g/L，万古霉素2.0～3.0g/L，初始pH为7.0～7.2。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述魏斯氏菌是魏斯氏属的菌株，包括类肠膜魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、窦氏魏斯氏菌、绿色魏斯氏菌、微小魏斯氏菌、赫伦魏斯氏菌、坎氏魏斯氏菌、或土壤魏斯氏菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将待分离的样品接种至选择性培养基，在30～37℃静置富集培养12～24h，将上述培养液稀释涂布至固体的选择性培养基，30～37℃培养24～36h。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

1)将待筛选的样品接种于选择性培养基，于37℃恒温培养箱中培养24h得培养液，所述的选择性培养基的配方如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0mL/L、磷酸氢二钾2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，万古霉素20g/L，调节初始pH为7.0；

2)将上述培养液稀释涂布至固体选择性培养基，37℃培养36h；所述的固体选择性培养基是含20g/L琼脂的步骤(1)所述的选择性培养基；

3)根据SEQ ID NO.1设计引物，挑取步骤2)获得的单菌落进行特异性引物菌落PCR，PCR产物用2％浓度的琼脂糖凝胶电泳成像，能够得到大小为120～180bp的条带的菌株为魏斯氏菌。

8.一种魏斯氏菌的标记物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.权利要求8所述的标记物在食品、生物、医药领域鉴定菌种方面的应用。

10.权利要求1～7任一所述的方法在高通量筛选方面的应用。