[发明专利]一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效筛选魏斯氏菌的标记物及其应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

魏斯氏菌是革兰氏阳性菌，属兼性厌氧、在有氧条件下生长迅速。不具备细胞色素、过氧化氢酶阴性。可通过磷酸戊糖和磷酸转酮酶途径异型发酵葡萄糖产D-和/或L-乳酸所，异型发酵葡萄糖还产CO₂、乙醇和(或)乙酸。魏斯氏菌在15℃能生长，一般最适生长温度在30-37℃，有些菌株在42～45℃能生长。大部分魏斯氏菌来源于营养丰富的食品，食品来源的魏斯氏菌发酵产乳酸、乙酸、乙醇可增加发酵食品的风味及营养，其中产细菌素的W.cibaria应用于食物，可起到防腐的作用；W.confusa合成葡聚糖、果聚糖，能有效地促进体内有益菌生长，抑制腐败菌生长；泡菜中W.koreensis菌株通过合成纤维素，具有抗肥胖效果。

目前分离鉴定魏斯氏菌的技术有通过菌落形态特征观察、革兰氏染色镜鉴、接触酶试验、甲基红试验、V-P试验、明胶液化试验、吲哚试验、淀粉水解试验等生理生化试验对菌株进行分离鉴定；通过糖发酵试验、菌株在4％NaCl、6.5％NaCl下是否生长，菌株在温度为10、40、45℃下是否生长的试验，初步进行魏斯氏菌种间鉴定。但是筛选周期通常需要一周左右，且需测定的参数多、步骤繁琐、工作量大。利用生理生化指标分离筛选鉴定魏斯氏菌，准确性不高，需进一步的扩增菌株的16S rDNA序列进行验证。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种魏斯氏菌的标记物，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种筛选魏斯氏菌的方法，根据SEQ ID NO.1所示序列设计引物，对待筛选的微生物进行菌落PCR，再将PCR产物进行凝胶核酸电泳分析和/或测序验证，扩增获得与SEQ ID NO,1所示序列存在≥75bp连续相同的核苷酸序列的菌株，或能够扩增出片段大小为120～180bp的菌株即为魏斯氏属的菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述引物序列包括(1)～(5)任一对，其中，

(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；

(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；

(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；

(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；

(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。

在本发明的一种实施方式中，所述PCR是按照以下程序进行的：94℃30s，94℃3min，55℃30s，72℃1min，72℃10min，12℃保持，循环数32。

在本发明的一种实施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为魏斯氏属(Weissella)的微生物。

在本发明的一种实施方式中，采用上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为融合魏斯氏菌(Weissella confusa)。

在本发明的一种实施方式中，采用上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为窦氏魏斯氏菌(Weissella cibaria)。

在本发明的一种实施方式中，采用上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为绿色魏斯氏菌(Weissella viridescens)。

在本发明的一种实施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA扩增获得片段大小为120～180bp的菌株即为类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)。