[发明专利]呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒

权利要求书

1.一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒用于同时检测以下病原体：流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌；

试剂盒内设有呼吸道病原体的引物组合和探针组合，同时设有人GAPDH基因內源对照以及阳性对照和阴性对照；

其特征在于引物组合为由如下多重特异性保守简并引物组成，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T，各对引物的碱基序列5’-3’如下：

流感病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCTTTYACNGADGARGGAGCAA，

反向引物：Cy5-5’-AYSYCAAYTGCATTTTTGACATCCT；

流感病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCCAATTCGAGCAGCTGAAACTG，

反向引物：Cy5-5’-TCCGTRACYAGTCTAATTGTCTCYCTC；

副流感病毒1型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGYAGAT，

反向引物：Cy5-5’-AGAAAYTRCCGGKTTTARATCAGGATACAT；

副流感病毒2型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：ACAATGTAATRCTTGGAGATTGYCTYGAT，

反向引物：Cy5-5’-GCTTTTSCGATTGATTCCATCACTTAGG；

副流感病毒3型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TGGCATAATGTGYTATCAAGACCAGG，

反向引物：Cy5-5’-TCYARTATRACAGATGAYACAATGCTYCCT；

副流感病毒4型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：WGCTCTTAGRATCATTGAAGTTGATGCA，

反向引物：Cy5-5’-GCWARGCTRATAGGCAAATCYCTGG；

人类偏肺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：YGARGTMAATGCRACTGTRGCA，

反向引物：Cy5-5’-GCYGARCTYACAAAYTTTGAYACCA；

鼻病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCCGGAGGABTCAARGYGAG，

反向引物：Cy5-5’-TAGACCTGGCAGATGAGGCT；

鼻病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CYCCACTAGTYTGGTCGATGAGGCT，

反向引物：Cy5-5’-NTCACAAYCAAGCACATGCRRGTCTT；

鼻病毒C型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CACYGGYGACRGTGRYGTAGC，

反向引物：Cy5-5’-CCATCCCRYAATTRCTCRTTACGAC；

博卡病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：ACTGCTACTGAGATTGCAGCTC，

反向引物：Cy5-5’-GCAGTATCCGTTTTCGTGAAGTGTA；

腺病毒，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：AGACACCTACTTCAGTMTKGGGAA，

反向引物：Cy5-5’-GGCACRAAGCGCAGCRTCAG；

冠状病毒229E，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：AACGTTTCAGAACTAGAAAGGGCA，

反向引物：Cy5-5’-TGTAGGYTCAGTTTTAGCACCATCAA；

冠状病毒HKU-1，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CCTGGTACGATTYTGCCTCAAGG，

反向引物：Cy5-5’-ACGAKTATTGGGTCCACGTGAT；

冠状病毒NL63，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCCAAAGGTTTTCCACAGYTTGC，

反向引物：Cy5-5’-CTGCTCAATGAACTTAGGAAGGTTCTT；

冠状病毒OC43，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：CATTGTCGATCGGGACCCAA，

反向引物：Cy5-5’-TRCTGGATGTGCGCGAAGTA；

呼吸道合胞病毒A型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCAAATAYACCATCCAACGGAGC，

反向引物：Cy5-5’-YCCAGTGAATTTRTGATTRGCATCTTCTG；

呼吸道合胞病毒B型，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GGGCAAATACAAARATGGCTCTTAGC，

反向引物：Cy5-5’-TGYTTTTGYACATCATAATTGGGAGTGTC；

肺炎支原体，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GGCCCATACTCCTACGGGAG，

反向引物：Cy5-5’-GCGACTGCTGGCACATAGTT；

肺炎衣原体，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：TGTAAAGCACTTTCGCCTGGGAA，

反向引物：Cy5-5’-CACCCTCCGTATTACCGCAGCT；

嗜肺军团杆菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GATAAGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCGA，

反向引物：Cy5-5’-CTTTCATTTGYTGYTCGGTTAAAGCCA；

肺炎链球菌，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：GCTGGAAGAAAATCGCTGABAAGTG，

反向引物：Cy5-5’-GGTTTGAGGTAGTACCARCCTGTT；

內源对照GAPDH基因，反向引物5’端带Cy5标志：

正向引物：ATCTTCCAGGAGCGAGATCC，

反向引物：Cy5-5’-AGGGGGCAGAGATGATGAC；

并且，所述探针组合为顺序固定于基因芯片表面的如下所示核酸探针，包括呼吸道病原体特异性保守简并探针、GAPDH內源对照探针，阳性杂交点探针和阴性杂交点探针，其中简并位点的核苷酸表示为R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T，各探针的5’端做氨基标志，各条探针的碱基序列5’-3’如下：

流感病毒A型探针：

NH2-5’-GADGARGGAGCAATHGTDGGMGAAATYTCACCATTRCCTTCTYTTCCAGGACATACTDD；

流感病毒B型探针：

NH2-5’-CTGAAACTGCGRTGGGAGTCYTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAA；

副流感病毒1型探针：

NH2-5’-YAGATATAGGGAAGTCRTAYCAGGTTTTACAATTAGGTTAYATATCYTTAAATTCAGAT；

副流感病毒2型探针：

NH2-5’-CRRCATCTRAYCAGTATTTAKCAATGGGGATAATACAACAATCTGCTGCRGVRTTTCCA；

副流感病毒3型探针：

NH2-5’-CAAYGAATGTCCATGGGGACAYTCATGYCCRGATGGRTGYATAACRGGAGTRTATACHG；

副流感病毒4型探针：

NH2-5’-CCRCMRGATTATACATTAACYATTAAYCCAAGRTCTGGCTGGGATGAYATCAAGATCAG；

人类偏肺病毒探针：

NH2-5’-TYGAYGARTAYAGYAAAYTDGAHTTTGAYAARYTNACRGTYTGYGADGTWAAAACAGTT；

鼻病毒A型探针：

NH2-5’-DRRRGTGYGCAGGCAGCCACGCAGGCTRGAACACTGTYRCCAGTGGGGDDYTTCYAGCC；

鼻病毒B型探针：

NH2-5’-YYAGCCTGCGTGGCGGCCARCCCAGCDYHTGCTGGGACGCCHWTTYAHDGACATGGTGY；

鼻病毒C型探针：

NH2-5’-AAGRCHBKMRTGYGCTAVNHRTGABTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCYTAAMCC；

博卡病毒探针：

NH2-5’-ACRACTGTACTCTGACAGGATTTAAACAAAAATGGAATTTAGATAAAATTCCAAACYCA；

腺病毒探针：

NH2-5’-AARTTTAGRAACCCCACRGTGGCGCCYACCCACGATGTGACCACCGAYCGYAGCCAGCG；

冠状病毒229E探针：

NH2-5’-GRGTGGATTTGYCACCCAAGYTRYATTTTTATTATCTTGGCACAGGACCYCATAAAGMT；

冠状病毒HKU-1探针：

NH2-5’-CTATTATGTTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTTCTAATAGYCGRCCAGGTTCACGTTCTC；

冠状病毒NL63探针：

NH2-5’-ARTTGATTCCYAATCAGGCTGCDTTATTCTTTGATAGTGAGGTTAGCACTGAWGAAGTG；

冠状病毒OC43探针：

NH2-5’-TAGYGATGAGGCTATTYCGACTAGGTTTCCGCCTGGYACGGTACTCCCTCAGGGTTACT；

呼吸道合胞病毒A型探针：

NH2-5’-AYACTCCTAAYTAYGATGTRCAGAAACACATYAAYAAKYTATGTGGCATGTTATTAATC；

呼吸道合胞病毒B型探针：

NH2-5’-AGGATCAGCTGCTGTCATYCAGCAAATAYRCYATTCAACGTAGYACAGGAGATAATATT；

肺炎支原体探针：

NH2-5’-GCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAAC；

肺炎衣原体探针：

NH2-5’-TAATATCCAATYGATTTGAGCGTACCRGGTAAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGC；

嗜肺军团杆菌探针：

NH2-5’-TTGGGRAAGAAYTTTAARAATCAAGGCATWGATGTTARYCCGGAAGCAWTGGCTAAAGG；

肺炎链球菌探针：

NH2-5’-TACTATTTYRAYGWAGAAGGTGCCATGAAGACAGGCTGGGTCAAGTACAAGGACACHTG；

內源对照GAPDH基因探针：

NH2-5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTT；

阳性杂交点探针：

NH2-5’-CCCTCGGGTTAATGCGCGATTGTCACCACACGTTGCGAGTTATGTTGCTGCGGAGATGG；

阴性杂交点探针：

NH2-5’-GATCGTCGTTGGGCTTTAGATTTCTCTTATAGGCTCGGTCGGCGCCTCTCGCCCCGAGC。