[发明专利]呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种呼吸道常见病原体多重RT‑PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒使用多重特异性保守简并引物组合和探针组合检测22种呼吸道常见病原体中的一种或多种，同时设有内源对照以及阳性对照和阴性对照。本发明所涉及的检测试剂盒提高了对高突变病原体目标序列的覆盖率，避免了多重引物和探针之间非特异性交叉反应的问题，可实现单个反应体系同时检测多达20种以上的呼吸道常见病原体，为呼吸道常见病原体检测提供一种简单灵敏，快速通量大，可多指标并行检测的检测工具。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体为一种呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒。

背景技术

急性呼吸道感染是我国临床多发性常见病，可引起严重的并发症甚至死亡。常见感染病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体等，所引起疾病和疫情的病原学复杂，因此快速准确多指标的病原体检测将为疾病的诊治提供充足的依据，并为疫情的控制提供基础。

目前，常用的呼吸道病原检测技术包括病原体抗原检测和核酸检测两个方面。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫试纸条等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法，该类方法使用方便、快速，但缺点是检测灵敏度相对较低，并且随着抗原蛋白的变异，容易出现假阴性；同时抗原检测易受到多种因素的影响，造成假阳性。而基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的病原体检测技术，检测方法主要包括PCR(聚合酶链式反应)技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；荧光定量PCR方法灵敏度高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器，同时单管的检测指标数也很有限。多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，可以实现多重扩增与检测，其技术难点是要避免PCR过程中多条引物间的交联反应，并且各扩增子的最佳反应条件要一致，目前常规设计的多重PCR检测能力大概是10个指标左右，更优的多重引物设计方案会显著提高方法的多指标检测能力。基因芯片是目前非常实用的病原体检测技术，它可以和多重PCR技术配合使用，从而实现对目标病原体的多重扩增和多指标检测，该技术对多重引物和探针的灵敏度和特异性要求很高，合理的引物和探针设置是关键。

目前呼吸道病原体检测需要解决如下几方面的问题：一是病原体种类多样，已发现的常见病原体有二十几种，其中半数以上是RNA病毒，同时还包括多种DNA病毒、支原体、衣原体和细菌。复杂的病原学要求检测技术可以实现多达20个指标以上的平行检测，并且具有同时检测核酸RNA和核酸DNA的能力。二是绝大多数呼吸道病原体具有快速进化的特点，同一类病原体对应的是一大组不同的变异基因，并且有能力在短时间内突变出新的变异基因。这种特点给临床检测带来了非常大的挑战，要求检测技术对一大组变异基因具有很好的覆盖度，并且具有容忍基因变异的能力。三是呼吸道疾病是临床多发性常见病，发病快，并且有集中爆发的特点，这要求检测技术在短时间内可以同时处理多个临床样本，具备快速检测和高通量检测的能力。

发明内容

本发明的目的是通过使用多重特异性保守简并引物组合和探针组合解决常规引物和探针对高突变病原体检测覆盖率低的问题，解决多达20种以上呼吸道病原体单反应体系平行检测的问题，同时解决多重引物和探针之间非特异性交叉反应的问题，克服现有技术单反应体系检测指标较少，费时费力的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大的呼吸道病原体基因检测试剂盒。

本发明呼吸道常见病原体多重RT-PCR联合基因芯片检测试剂盒，该试剂盒用于检测以下病原体中的一种或多种：流感病毒A型、流感病毒B型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人类偏肺病毒、鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、博卡病毒、腺病毒、冠状病毒229E、冠状病毒HKU-1、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团杆菌和肺炎链球菌；