[发明专利]麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法与应用

权利要求书

1.一种麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化方法，该核糖体失活蛋白从麻疯树种子萌发4~49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳中分离纯化得到，相对分子量为31.398kDa，等电点为7.12，该核糖体失活蛋白的N-末端的氨基酸残基的序列如序列表中SEQ ID No：1所示，其特征在于步骤如下：

（1）制备粗提液

①将麻疯树种子萌发，收集萌发4~49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳，将收集的子叶或/和胚乳用液氮研磨至粉状，然后向所得粉状物料中加入缓冲液A将粉状物料溶解并匀浆至少3min，将所得匀浆液旋转至少2h，然后离心并收集上清液；

②在搅拌下向步骤①所得上清液中加入硫酸铵至硫酸铵在上清液中的饱和度为55%~65%，再搅拌至少2h，离心并收集上清液；

③在搅拌下向步骤②所得上清液中加入硫酸铵至硫酸铵在上清液中的饱和度为75%~80%，再搅拌至少2h，离心并弃上清液、收集沉淀，将所得沉淀溶解于缓冲液A中即得粗提液；

步骤（1）中，液氮研磨之后的操作均在0~8℃进行，缓冲液A温度为0~8℃；

（2）脱盐层析及缓冲液交换

采用缓冲液B进行柱平衡，然后将步骤（1）所得粗提液作为样品上样，上样后用缓冲液B洗脱，收集第一个280nm吸收峰对应的洗脱组分，柱填料为Sephadex G 25 superfine；

（3）阴离子交换层析

采用缓冲液B进行柱平衡，然后将步骤（2）收集的洗脱组分作为样品上样，上样后先用缓冲液B冲洗至基线稳定，然后采用缓冲液B和缓冲液C进行线性梯度洗脱，收集线性梯度洗脱阶段最高的280nm吸收峰对应的洗脱组分，柱填料为Q Sepharose HP；该步骤进行线性梯度洗脱时，洗脱起始点缓冲液C的体积百分含量为0、缓冲液B的体积含量为100%，洗脱结束点缓冲液C、缓冲液B在缓冲液B和缓冲液C组成的混合液中的体积含量为分别30%~35%、70%~65%；

（4）凝胶过滤层析

采用缓冲液B进行柱平衡，然后将步骤（3）收集的洗脱组分作为样品上样，上样后用缓冲液B洗脱，收集最高的280nm吸收峰对应的洗脱组分，将收集的洗脱组分冷冻干燥，即得麻疯树核糖体失活蛋白，柱填料为复合交联琼脂糖和右旋糖苷；

所述缓冲液A由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液和NaCl配制而成，缓冲液A中，磷酸缓冲液的终浓度为0.5mmol/L、乙二胺四乙酸的终浓度为0.2mmol/L、NaCl的终浓度为0.5mmol/L，缓冲液A的pH值为8.0；所述缓冲液B由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液配制而成，缓冲液B中，磷酸缓冲液的终浓度为0.5mmol/L、乙二胺四乙酸的终浓度为0.2mmol/L，缓冲液B的pH值为8.0；所述缓冲液C由磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液和NaCl配制而成，缓冲液C中，磷酸缓冲液的终浓度为0.5mmol/L、乙二胺四乙酸的终浓度为0.2mmol/L、NaCl的终浓度为1mmol/L，缓冲液C的pH值为8.0。