[发明专利]麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法与应用

说明书

本发明提供了一种麻疯树核糖体失活蛋白及其制备制备方法，该核糖体失活蛋白从麻疯树种子萌发4～49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳中分离纯化得到，相对分子量为31.398kDa，等电点为7.12该核糖体失活蛋白的N‑末端的氨基酸残基的序列如序列表中SEQ ID No：1所示。本发明还提供了所述麻疯树核糖体失活蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用，该核糖体失活蛋白对人骨肉瘤U20S、人非小细胞肺癌A549、人非小细胞肺癌H1975和人结肠癌HCT116均具有明显的增殖抑制作用，对人骨肉瘤U20S的离体增殖抑制效果优于Curcin和紫杉醇，并且对人正常肾细胞的毒性较低。

技术领域

本发明属于植物蛋白质的分离纯化技术领域，特别涉及麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康，但目前还非常缺乏有效的针对性治疗药物。植物中富含各种生物活性蛋白分子，从中寻找高效低毒的肿瘤治疗药物是一种有效途径。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs，EC 3.2.2.22)是一种存在于高等植物或真菌中的细胞毒素蛋白，多具有RNA N-糖苷酶或多核苷酸:腺苷糖苷酶活性，通过作用于核糖体28SrRNA上保守的sarcin/ricin环腺苷酸的N-C糖苷键，使核糖体失活，进而抑制蛋白质翻译的进行。根据结构，植物RIPs可分为I型和II型两大类，I型RIP为单链蛋白，II型RIP除了含有类似I型RIPs的A链，还通过二硫键连接具有凝集素活性的B链。研究显示，RIPs具有抗肿瘤、抗病毒和抗真菌等多种生物学活性，特别是I型RIPs和II型RIPs的A链显示出对肿瘤细胞的选择性杀伤作用，若将其与单克隆抗体结合制成免疫毒素，对肿瘤细胞的靶向性大大提高，有望开发成专一杀伤癌细胞的药物，在癌症治疗方面具有很大的发展潜能(Lin JY,Tserng KY,Chen CC,Lin LT,Tung TC.Abrin and ricin:new anti-tumour substances.Nature1970；227:292-293.)。

麻疯树(jatropha curcas L.)为大戟科麻疯树属植物，广泛分布于热带和亚热带地区，其种子含油量高达40％，被当作一种理想的能源植物而广泛栽培，资源丰富。林娟等从麻疯树种仁中成功分离纯化了胚乳型核糖体失活蛋白Curcin(麻疯树核糖体失活蛋白的分离纯化和作用机制研究，高技术通讯，2002，11，36-40)，并且发现其对胃癌细胞系SGC-7901、骨髓瘤细胞系Sp2/0、人肝癌细胞系(human hepatoma)的增殖有较强的抑制作用，对三者的半数抑制浓度依次为0.23mg/L、0.66mg/L和3.16mg/L(Lin Juan et al,Antitumoreffects of curcin from seeds of Jatropha curcas,Acta Pharmacologica Sinica,2003,24(3),241-246)。Nuchsuk等从麻疯树种壳中分离纯化出了一种分子量为38.938kDa的核糖体失活蛋白，该蛋白能抑制人乳腺癌MCF7细胞、结肠癌SW620和肝癌HepG2细胞的增殖，对三者的半数抑制浓度依次为0.15mM、0.25mM和0.40mM。由以上内容可知，麻疯树中存在多种核糖体失活蛋白变异体，不同的变异体虽然序列类似，但活性却存在较大差异，因此在麻疯树中继续挖掘新的、抗肿瘤活性高的核糖体失活蛋白，对于恶性肿瘤的针对性治疗将产生积极的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的麻疯树核糖体失活蛋白及其分离纯化方法，以增加麻疯树核糖体失活蛋白的种类，并证明该麻疯树核糖体失活蛋白具有抗肿瘤活性，可作为制备治疗肿瘤的药物应用。

本发明提供的麻疯树核糖体失活蛋白，将该核糖体失活蛋白记作Curcin C，Curcin C从麻疯树种子萌发4～49天的麻疯树幼苗的子叶或/和胚乳中分离纯化得到，Curcin C的相对分子量为31.398kDa，等电点为7.12，Curcin C的N-末端的氨基酸残基的序列如序列表中SEQ ID No：1所示。