[发明专利]流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测H7N9亚型流感病毒的方法

说明书

本发明公开了一种流感病毒rRT‑PCR检测引物和探针及检测H7N9亚型流感病毒的方法，包括两组可以特异性检测新型高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因特异性引物和探针共3条寡核苷酸引物和1条探针序列，同时公开了待检样本的处理、rRT‑PCR反应体系及反应条件、结果分析。本发明可以快速甄别新型高致病性H7N9亚型流感病毒,操作简单、应用方便，为临床诊断、检验检疫等领域的病例诊断提供了可行的技术方法。

技术领域

本发明涉及一种流感病毒检测技术，尤其涉及一种流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测H7N9亚型流感病毒的方法。

背景技术

流感病毒中的A型流感病毒常常以前世界范围内的大流行，根据流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)可以将A型流感病毒划分为18个HA亚型和11个NA亚型。野生水禽是A型流感病毒的天然宿主，对于任何一个禽流感病毒，要实现由天然宿主一步步跨种传播感染的过程，受到很多因素的影响，包括病毒、宿主以及环境因素等。

每年都有偶发的人感染禽流感病毒病例发生。2013年我国首次在上海等地不明原因肺炎死亡病例中发现一种新型重配的H7N9亚型流感病毒是其病原，该病毒是由野鸟中的H7亚型禽流感病毒与鸭中流行的N9亚型禽流感病毒形成H7N9禽流感病毒前体病毒，该前体病毒进一步传入到鸡群中，与鸡群中流行的H9N2亚型禽病毒进一步重配，获得H9N2亚型禽流感病毒的6个内部基因形成目前在鸡群中流行的新型H7N9亚型禽流感病毒。该病毒每年冬春季都会造成人感染病例的一个流行高峰，截止到2017年2月，该病毒已经造成1258人感染，其中477人死亡。人感染该病毒后主要重症肺炎、多器官衰竭等严重临床症状，病死率高达40％，对民众健康造成重大威胁。因此如何对病例早期诊断对于指导临床治疗至关重要。发明人2013年成功研发了可以检测H7N9亚型流感病毒的检测方法，但是2017年2月19日，发明人同广东省疾病预防控制中心共同发现H7N9亚型流感病毒发生了新的变异，在其血凝素蛋白的剪切位点插入了4个氨基酸，导致剪切位点处突变为含有3个碱性氨基酸，表明病毒已经从以前对鸡不致病变成了对鸡高致病的病毒，对人的致病性影响还不清楚。随后农业部门在鸡中发现了同样的病毒，表明该病毒已经在我国部分地区的鸡群中流行，因此不仅对我国养禽业造成巨大威胁，而且会导致人的感染和死亡。因此本专利专门针对该变异高致病性病毒，应用特异性高的Taqman探针以及PCR引物，能够快速特异性地检测血凝素基因突变区域，可以区别低致病性H7N9流感病毒，也可鉴别诊断其他亚型流感病毒，可以用于人感染病例的诊断以及禽类产品的检疫等，应用范围广。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测H7N9亚型流感病毒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针：

针对新型高致病性H7N9亚型禽流感病毒HA基因裂解位点及附近相对保守区域设计的两组引物探针，两组引物的正向引物和探针相同，反向引物不同，即共计有正向引物一条，反向引物两条，探针一条。

本发明的应用上述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针检测H7N9亚型流感病毒的方法，包括步骤：

首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取H7N9亚型流感病毒RNA；

然后，利用一步法rRT-PCR试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；

之后，根据Ct值判断rRT-PCR检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法，由于包括针对新型高致病性H7N9亚型禽流感病毒HA基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测新型高致病性H7N9亚型流感病毒，操作简单、应用方便。