[发明专利]一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法

说明书

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种用于LC‑MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法。所述方法包括：黄曲霉菌菌株培养；黄曲霉菌淬灭；黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取；黄曲霉菌代谢组分析。本发明采用冷甘油缓冲溶液结合快速抽滤法进行淬灭，以MeOH/DCM/ACN/EA/HCOOH混合溶液作为提取溶液，实现了高效提取不同极性化合物的目标，代谢组化合物覆盖率高；采用本发明所述方法对黄曲霉菌细胞代谢组学进行前处理可以保证代谢组学分析方法的可重复性、稳定性，降低检测结果的假阳性。

技术领域

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法。

背景技术

黄曲霉代谢组是黄曲霉菌基因组、转录组、产毒机理等系统生物学研究中不可缺少一环，但目前的黄曲霉代谢组检测方法远远不能满足系统生物学研究的需要。前处理方法不佳严重影响了黄曲霉代谢组的覆盖率，往往含量较低且具有重要标志作用的代谢化合物没有被检测出来。

黄曲霉代谢组研究属于微生物代谢组学研究范畴。微生物代谢组学是以微生物为研究对象，旨在研究细胞生长周期某一时刻胞内外所有小分子量的代谢物。微生物是地球上代谢最多样的生物体，细胞内酶系活跃，代谢物转换迅速，因此样品的培养条件是否稳定及样品的处理方法会显著影响分析结果的准确性。

目前，微生物代谢组学正处于其发展初级阶段。由于微生物本身具有系统简单、基因组数据丰富及代谢网络和生理特性了解全面等系列优势，微生物代谢组学已经成功地应用于新药开发、突变体筛选、微生物代谢工程、微生物降解污染物以及微生物与宿主间的病理关系等方面。有关黄曲霉菌的代谢组学研究刚刚起步，Roze等人用代谢组学的方法比较了黄曲霉菌野生型菌株和VeA突变的菌株的代谢物，发现有些挥发性成分的变化，揭示了VeA调节分支氨基酸和乙醇代谢的功能。

因此，发明一种黄曲霉代谢组的高效前处理方法和宽覆盖率检测方法，对于深入研究黄曲霉菌生理代谢及相关环境响应机制具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，包括如下步骤：

(1)黄曲霉菌菌株培养：黄曲霉菌在固体培养基培养后，用无菌水将孢子从培养基上洗下，然后接种至液体培养基中扩培后得到黄曲霉菌样品；

(2)黄曲霉菌淬灭：将步骤(1)所得黄曲霉菌样品加入到冷甘油缓冲溶液淬灭剂中，快速混合涡旋、均质，然后置于低温条件下冷却，再通过真空抽滤快速过滤混合液，收集固体样品，冷冻干燥；

(3)黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取：将步骤(2)冷冻干燥所得黄曲霉菌细胞样品破碎，利用代谢组提取液进行提取处理，再经离心、膜过滤后得到代谢组提取溶液；

(4)黄曲霉菌代谢组分析：步骤(3)所得代谢组提取溶液进入HPLC-MS系统进行分析检测，然后依据所得谱图进行黄曲霉菌代谢组分析。

上述方案中，所述黄曲霉菌菌株培养的方法为：黄曲霉接种在察氏固体培养基基上、置于18～38℃培养8～12d后，用无菌水将孢子从固体培养基上洗下，然后接种至沙氏液体培养基中、置于恒温摇床培养5～7天，得到黄曲霉菌样品。

上述方案中，所述无菌水中含有体积分数为0.05～0.2％的吐温-80，所述沙氏液体培养基中黄曲霉菌的接种量为1×10⁵～5×10⁵个/mL；所述恒温摇床培养的温度为25～30℃，摇床转速为150～250r/min。