[发明专利]一种多重PCR检测微生态活菌制剂中食源性致病菌的方法

说明书

1 技术领域

本发明涉及食品安全性检测领域，具体地说，涉及一种多重PCR技术检测微生态活菌制剂中是否食源性致病菌超标的方法。

2 背景技术

食源性疾病是指通过摄食而进入人体的有毒有害物质(包括生物性病原体)等致病因子所造成的疾病。一般可分为感染性和中毒性,包括常见的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、寄生虫病以及化学性有毒有害物质所引起的疾病。食源性致病菌能引起食源性疾病或者食物中毒，甚至会影响人类的人身安全，造成重大经济财产损失，降低人们的生活质量。

据世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)报道,全球每年发生腹泻病的病例数高达1.5亿，其中70％病例与各种致病性微生物污染的食品有关。我国的研究资料也显示，微生物是食源性疾病的主要病原，占46.4％。食品中的生物性污染无论在发达国家还是发展中国家都是影响食品安全的最主要原因。食品安全是全球性的重大公共卫生问题。致病微生物污染带来的食品安全事故也不断的被报道，如英国的疯牛病、法国的李斯特氏菌病、日本的肠出血性大肠杆菌O157:H7和雪印牛奶的葡萄球菌肠毒素中毒事件、我国安徽阜阳劣质婴幼儿配方粉事件等。

国家依据“食源性疾病监控技术的研究”建立了全国食源性疾病监测网络,对食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希菌O157:H7等目前国际公认的食源性致病菌进行了监测和预警,以期为有针对性地预防和控制食源性疾病的发生提供参考。

目前食源性致病菌的检测方法过主要是通过化学、微生物学、生物物理学、免疫学以及血分子生物学技术对食源性致病菌进行检测。最早的传统生化鉴定试验，主要包括食源性致病菌检测步骤为：增菌培养、分离纯化、革兰氏染色、生化试验及血清学试验等一系列步骤，过程周期长，操纵复杂。随着生物技术的发展与分子生物学的进展，发明了多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，PCR技术检测周期较短，灵敏度高，特异性强等特点。根据PCR技术发展，可直接用菌液进行食源性致病菌的检测，包括多重PCR，荧光定量PCR等技术。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。所采用的荧光物质分为荧光染料和荧光探针，SYBR Green I荧光染料和TaqMan探针法较为常见。该方法广泛应用于食品中单核增生李斯特、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌等病原致病菌的检测。多重PCR原理跟常规PCR相同，只是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的DNA片段，采用该方法可同时检测多种病原微生物，多重PCR技术有成本低，灵敏度高，周期短等特点。免疫学的方法主要有乳胶凝集反应、酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫胶体金技术等。乳胶凝集反应是利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上具有良好吸附性的大分子的乳胶颗粒作为载体吸附可溶性抗原于其表面，当特异性抗体与之结合后，产生凝集反应。酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术是1971年，Engvall建立了ELISA方法是一种固相免疫分析方法它将受检标本吸附于固相载体表面的抗原或抗体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后，通过定性或定量分析有色产物量来确定样品中待测物质含量。目前该方法已被广泛应用于多种细菌检测，如食品中大肠杆菌O157、单增李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌等。

微生态制剂，是在微生态学理论指导下，调整微生态失调，保持微生态平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代谢产物和选择性促进宿主正常菌群生长的物质制剂总称。微生态活菌制剂中含有大量的微生物活体，多则能达到10¹⁰CFU/mL。目前多以乳酸菌为主，涉及到革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，有时还会添加进酵母菌等。