[发明专利]一种改进的细菌活菌计数方法

权利要求书

1.一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括操作步骤：使用抗生素药瓶对活菌发酵液或者培养物进行浓度梯度稀释，振荡均匀后，用安装上7号金属针头的注射器垂直滴在相应的琼脂细菌计数平板上，静置后置于恒温培养箱中培养后取出直接计数即可。

2.根据权利要求1所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括分装抗生素药瓶无菌液体的操作步骤，抗生素药瓶和瓶盖要配套使用，方法是：先将清洗洁净且干燥后的抗生素药瓶和瓶盖经121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理，然后40℃-120℃烘干至完全干燥后冷却至室温，再用微量移样器或无菌吸管依次向抗生素药瓶中加入经过121℃-126℃×30min-60min的灭菌处理后冷却至室温的9Bml无菌生理盐水，无菌操作取出瓶盖盖上，放置在超净工作台中备用；再向抗生素药瓶中加入Bml待稀释菌液，使用漩涡振荡器对加有Bml待稀释菌液、总装量为10Bml的抗生素药瓶进行振荡稀释，振荡时间为15s-90s；使用安装上7号金属针头的注射器将振荡后的稀释菌液垂直滴在相应的细菌计数平板上，每个平板中滴入1-100滴，操作完成后平板静置的时间为5min-360min。

3.根据权利要求2所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括操作步骤：清洗抗生素药瓶和瓶盖，晾干或烘干后分别装入无菌布袋扎好口后备用；清洗培养皿晾干或烘干后以5-11个为一组用报纸包好备用；将7号金属针头装入培养皿中和注射器、镊子、Bml微量移液器、5Bml微量移液器一起用报纸包好备用；用三角烧瓶分别装入固体琼脂培养基与食盐浓度为0.85%的生理盐水，用报纸扎好瓶口后备用；将以上材料依次放入高压灭菌锅中，盖上盖后开启电源升温，设定灭菌条件为121℃-126℃恒温30min-90min；取出自然降温至室温，将其它灭菌后的材料置烘箱中高温恒温置干燥无水分，然后取出放置于无菌室中自然降至室温。

4.根据权利要求3所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括操作步骤：配制新洁尔灭消毒液对环境和空间消毒后，开启紫外灯管进行紫外线消毒。

5.根据权利要求4所述的一种改进的细菌活菌计数方法，其特征在于，包括细菌计数操作步骤：其中，

（1）倒平板

将固体琼脂培养基重新加热融化后降温至45-100℃倒平板；

（2）分装9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中并塞好瓶塞

点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出5Bml的微量移液器，将移液量设定为4.5Bml，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用微量移液器依次吸取两次共9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶；

点燃超净工作台中的酒精灯，用无菌镊子夹取浸泡在75%酒精中的棉花团擦拭双手及超净工作台台面，取出无菌吸管，将抗生素瓶取出排放在超净工作台台面，用吸管吸取9Bml无菌生理盐水于抗生素瓶中，然后用无菌镊子夹取瓶塞轻轻盖上抗生素瓶；

（3）样品准备

粉末样品：利用百分之一或万分之一天平准确的称取样品X克加入到10X ml无菌生理盐水的三角烧瓶中，置摇床上0r/min-300 r/min振荡0-120min；

半固体样品、膏状样品：将灭过菌的烧杯放在百分之一或万分之一天平上，清零后，用无菌取样匙取X1克膏状样品于烧杯中，将烧杯移至超净工作台中，准确的加入样品重量10倍的无菌生理盐水，然后放入经过灭菌的搅拌子，开启磁力搅拌器进行搅拌，搅拌时间0-120min；

液体样品：用微量移液器定量移取X2 ml液体样品于无菌三角烧瓶中，用微量移液器或无菌吸管准确的加入液体样品体积9倍的无菌生理盐水，然后放入经过灭菌的搅拌子，开启磁力搅拌器进行搅拌，搅拌时间0-120min；

以上样品搅拌或振荡均匀后记为10^-1；

（4）10倍浓度梯度稀释

取微量移液器吸取Bml10^-1稀释液于含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10^-2；

用微量移液器吸取Bml10^-2的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10^-3；

用微量移液器吸取Bml10^-3的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10^-4；

用微量移液器吸取Bml10^-4的菌悬液放入含9Bml生理盐水的抗生素瓶中，置漩涡振荡器中振荡25秒，记为10^-5；

依次类推，分别得到10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10的活菌稀释液；

（5）细菌计数滴定

选取合适梯度的菌悬液，如10^-A、10^-(A+1)、10^-(A+2)，取一块固体琼脂平板，在底部用记号笔将平皿平均分成120度的三个扇形区域，并依次标记10^-A、10^-(A+1)、10^-(A+2)；

用安装有7号金属针头的注射器吸取1ml10^-(A+2)菌悬液，往超净工作台中的废液缸中排出0.2ml菌悬液清洗金属针头，然后将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10^-(A+2)菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10^-(A+2)区域，依次滴三滴，完成10^-(A+2)菌悬液三个重复样测定；

滴定完后，将注射器内残留的10^-(A+2)菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10^-(A+1)菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml 10^-(A+1)菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10^-(A+1)菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10^-(A+1)区域，依次滴三滴，完成10^-(A+1)菌悬液三个重复样测定；

滴定完后，将注射器内残留的10^-(A+1)菌悬液排入超净工作台中的废液缸中，然后用此注射器吸取1ml10^-A菌悬液全部排入到超净工作台中的废液缸中清洗注射器及针头，然后吸取1ml 10^-A菌悬液，将注射器垂直放置于固体琼脂平板正上方，轻压注射器活塞将10^-A菌悬液0.01ml滴入固体琼脂平板10^-A区域，依次滴三滴，完成10^-A菌悬液三个重复样测定；

（6）培养

将固体琼脂平板在超净工作台中静置10-120min后，倒置用报纸包好放入蜡烛缸中置恒温箱中培养24h-48h；

（7）细菌计数

经过24h-48h培养后，取出固体琼脂平板计数；

三个浓度梯度三个重复细菌计数结果如下表：

10^-A10^-(A+1)10^-(A+2)多不可计45 44 474 5 4,

该样品细菌总数为：

（（45+44+47）/3）×10^(A+1)×100=4.53×10^(A+4)CFU/ml，

或（（45+44+47）/3）×10^(A+1)×100=4.53×10^(A+4)CFU/g。