[发明专利]一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种家蚕BmBDV病毒LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括BmBDV病毒LAMP预反应液：所述预反应液包括引物BmBDV-FIP和BmBDV-BIP、引物 BmBDV-F3和BmBDV-B3、引物BmBDV-LF和BmBDV-LB、 探针BmBDV-FITC-PROBE；

其中所述引物BmBDV-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，引物BmBDV-BIP的序列如SEQ IDNO:4所示，引物 BmBDV-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，引物BmBDV-B3的序列如SEQ ID NO:2所示，引物BmBDV-LF的序列如SEQ ID NO:5所示，引物 BmBDV-LB的序列如SEQ ID NO:6所示， 探针BmBDV-FITC-PROBE的序列如SEQ ID NO:7所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各引物和探针含量为：1.5～2.0mM 引物BmBDV-FIP和BmBDV-BIP，0.2～0.4mM引物 BmBDV-F3和BmBDV-B3，0.2～0.5mM引物BmBDV-LF和BmBDV-LB，0.05～0.1μM 探针BmBDV-FITC-PROBE。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述LAMP预反应液还包括：20～40mM Tris-HCl， 10～15mM 氯化钾， 15～20mM 硫酸铵， 8～10mM 硫酸镁， 0.1～0.2% Triton X-100，1.2～1.4mM dNTP， 6-8U Bst DNA 聚合酶大片段，0.6～0.8M 甜菜碱。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品、阴性对照样品以及LAMP核酸反应管中添加有稳定液，其中LFD试纸用的缓冲液为1×TAE缓冲液，阳性对照样品为BmBDV病毒基因组DNA，阴性对照样品为无核酸的去离子水，核酸反应稳定液为液体石蜡油。

5.权利要求1-4任一项所述试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于非诊断目的的家蚕BmBDV病毒信息的获取。

6.一种家蚕BmBDV病毒信息的获取方法，所述方法用于非诊断目的，采用权利要求1所述的试剂盒进行检测，按照下述步骤进行：

S1. 家蚕样品中BmBDV基因组DNA的快速提取：

S2. 家蚕BmBDV病毒LAMP扩增：

（1）根据待检样品数，配制所需的预反应液，在预反应液中加入2～5μL DNA模板，再加入适量的去离子水，使反应体系总体积为25μL；

（2）标记清楚后，将检测反应管置于61-65℃，反应30～60min，80℃灭活；

S3.家蚕BmBDV病毒LFD试纸检测：

（1）取家蚕BmBDV病毒LAMP扩增产物6～10μL，置于LFD试纸加样孔；

（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50～100μL缓冲液，待缓冲液移动到试纸的另一端，表明反应基本结束，根据显色条带情况判断LAMP-LFD检测的结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述反应温度为62℃，反应时间为30min。