[发明专利]一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种家蚕BmBDV的LAMP‑LFD快速试剂盒及检测方法，属于病毒疫病诊断技术领域，所述试剂盒中涉及的引物和探针是根据GenBank公布的家蚕BmBDV病毒序列的保守区域设计，提取BmBDV病毒DNA，使用本发明建立的BmBDV LAMP反应体系进行检测，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，结果显示在62℃反应30min后，BmBDV病毒DNA获得了高效特异性扩增，同现在该病毒的常用检测技术相比，本发明具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，而且适用于生产一线的技术人员和蚕农现场使用，有利于该病毒病的诊断与预防。

技术领域

本发明涉及一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法，属于病毒疫病诊断技术领域。

背景技术

家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori Bidensovirus，BmBDV）属于细小病毒科浓核病毒亚科，该病毒具有高致死率，感染持续时间较长，引起慢性蚕病，是我国夏秋季节蚕茧等经济产品减产的重要原因之一。研究表明，BmBDV为无囊膜的球状病毒粒子，直径约20-24nm，包含2个线性单链DNA分子，大小分别约6.5kb（VD1）和6kb（VD2），其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号DQ017268和DQ017269）。目前该病毒的检测方法主要为常规PCR检测法，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，反应时先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增。该技术简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察、侧向流层析试纸技术(LFD)等方法。

其中，LAMP-LFD法使得反应结果可以直接用肉眼观察，具有安全、快捷、高效的特点，适合应用推广。而且截止目前，该技术在家蚕BmBDV的检测中未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的缺陷，提供一种通过快速检测家蚕BmBDV的环介导恒温扩增方法检测家蚕家蚕二分浓核病毒的方法，并提供一种用于以上目的的LAMP-LFD检测试剂盒。所述试剂盒特异性强，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合家蚕BmBDV的筛查。

本发明所述的家蚕BmBDV病毒LAMP-LFD检测试剂盒包括：BmBDV病毒 LAMP预反应液：所述预反应液包括引物BmBDV-FIP和BmBDV-BIP、引物 BmBDV-F3和BmBDV-B3、引物BmBDV-LF和BmBDV-LB、 探针BmBDV-FITC-PROBE；

其中所述引物BmBDV-FIP如SEQ ID NO:3所示，引物BmBDV-BIP如SEQ ID NO:4所示，引物 BmBDV-F3如SEQ ID NO:1所示，引物BmBDV-B3如SEQ ID NO:2所示，引物BmBDV-LF如SEQ ID NO:5所示，引物 BmBDV-LB如SEQ ID NO:6所示， 探针BmBDV-FITC-PROBE如如SEQID NO:7所示。