[发明专利]Il2rg基因敲除的动物模型的构建方法及其短肽

说明书

本发明提供一对短肽、一对转录激活子样效应因子、一对DNA载体，本发明所述的短肽能够对大鼠Il2rg基因进行准确、高效的打靶，快速获得Il2rg基因敲除大鼠。本发明还提供了一种敲除Il2rg基因的方法以及一种Il2rg基因敲除的动物模型的构建方法，由此得到的大鼠可用于肿瘤异体移植研究、人源化大鼠开发和自身免疫及感染性疾病研究，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一对短肽、一对转录激活子样效应因子及敲除Il2rg基因的方法、构建Il2rg基因敲除的动物模型的方法。

背景技术

IL2RG基因编码的白细胞介素-2受体的γ链(IL2Rγc)是多种白介素信号通路的受体元件，主要负责介导白细胞介素家族因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的信号转导。已有研究发现，人的IL2RG基因突变可以引起X染色体基因传导的重度联合免疫缺陷病(X-linked severe combined immunodeficiency,X-SCID)，严重影响机体内T细胞和NK细胞的分化成熟以及B细胞的正常功能，使得免疫能力严重缺失。作为一种细胞和体液免疫缺陷，X-SCID约占SCID病例的50-60％，发病率约为二十万分之一。

全世界范围内针对人类不同疾病进行治病机理研究和药物开发从未停止，但由于受到人类自身伦理和技术实现的限制，很多研究不能在人类自体上直接进行，而需要在与人类相近的动物体上进行实验。就IL2RG基因而言，人IL2RG基因定位于Xq13.1，NCBI基因ID为3561，编码含369个氨基酸的蛋白质，其cDNA与小鼠Il2rg cDNA有约66％的同源性，与大鼠Il2rg cDNA有约71％的同源性。小鼠Il2rg基因定位于X 43.9cM，NCBI基因ID为16186，大鼠Il2rg基因定位于Xq22，NCBI基因ID为140924，动物体的IL2rg基因相关实验对人类疾病研究和药物开发具有重大参考意义。

目前，已有文献表明Il2rg基因敲除的小鼠具有发育不全的胸腺，免疫功能严重降低，表现出与人类相似的病理特征(Cao X，et al.Immunity(1995)Mar；2(3):223-38；DiSanto JP,et al.(1996)Proc Natl AcadSci U S A 92:377–381Ohbo K,et al.(1996)，Blood 87:956–967)。Il2rg基因及双基因和多基因敲除小鼠表现出不同程度的免疫缺陷，已经广泛应用于疾病研究、异体移植和人源化小鼠的制备中。

上述文献采用小鼠作为研究对象，而大鼠作为啮齿类模式动物，也是人疾病相关基础研究和药物开发不可或缺的动物模型。近年来通过基因工程技术改造大鼠特定基因从而得到特定基因型和表型的模式大鼠已经成为研究热点，其中免疫缺陷大鼠模型的建立对人类疾病研究和药物开发具有重大意义。与小鼠相比，大鼠生理结构更接近人类，其体形大，能够提供足够血样且易于进行手术操作，可以弥补小鼠模型的不足。但是，有关大鼠免疫系统疾病的研究和模型开发仍处于起步阶段，由于胚胎干细胞提取和培养方法在大鼠上还不成熟，因此，长期以来利用传统方法制备大鼠基因敲除模型比较困难。

为解决上述技术问题，日本的TomojiMashimo等人(2010年)使用ZFN技术制备了F344背景的IL2rg基因敲除大鼠(PLoS One.2010Jan25；5(1):e8870)，该大鼠胸腺极度发育不全，检测发现其T和B细胞部分功能缺失，NK细胞活性低，表现出免疫系统缺陷，人源肿瘤细胞移植成瘤率远高于裸大鼠且肿瘤生长较好。进一步的研究表明该大鼠模型作为人类神经异种移植的良好宿主动物，可用于制备得到帕金森(PD)模型大鼠(BumpeiSamata，Journal of Neuroscience Methods 243(2015)68–77)。

但是，上述ZFN方法制备大鼠模型具有以下缺点：(1)成本高、打靶载体构建和筛选过程复杂，且具有细胞毒性高和脱靶率高等缺陷；(2)F344大鼠因自身血清胰岛素含量低、脑垂体大、易自发生成肿瘤，因此被广泛用于癌症发生的研究，局限性较大。