[发明专利]一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法

权利要求书

1.一种人体外周血中单核样髓源抑制细胞的检测方法，其特征、步骤和条件如下：

A、所用的抗体

(101) 抗体APC anti-human CD33，简称CD33；

(102) 抗体PE anti-human CD15，简称CD15；

(103) 抗体PE-CF594 anti-human HLA-DR，简称HLA-DR；

(104) 抗体 APC-H7 anti-human CD14，简称CD14；

(105) 抗体PE-Cy7 anti-human CD45，简称CD45；

(106) 抗体FITC anti-mouse CD11b，简称CD11b；

B、所用溶液的制备

(201) PBS溶液的制备：称取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.44 g及KH₂PO₄ 0.24 g溶于1 L超纯水中，高压灭菌，得到PBS溶液，4 ℃冰箱保存；

(202) 缓冲液的制备：取新生牛血清1mL，加入到9 mL的PBS溶液中得到10 mL的缓冲液；所述的新生牛是出生6 小时内的小牛；

(203) 红细胞裂解液的制备：称取NH₄Cl 7.47 g、Tris 2.06 g溶于500 mL超纯水中，将溶液调节pH至7.2，继续加入超纯水直至总体积为1 L，得到红细胞裂解液，4℃冰箱保存；

(204) 固定液的制备：量取10 mL甲醛溶液加入至1 L 步骤(201)制备的 PBS溶液中，再加入葡萄糖20 g，NaNO₃ 0.2 g，完全溶解，得到固定液，室温备用；

(205) 抗体混合溶液的制备：在步骤(202)制备的200 μL缓冲液中加入4 μL的HLA-DR抗体，6 μL的CD15抗体，6 μL的CD45抗体，6 μL的CD33抗体，8 μL的CD14抗体和1 μL的CD11b抗体，混匀，得到抗体混合溶液，4 ℃冰箱避光保存；

C、流式样本溶液的制备

(301) 取受试者外周血血液样本10 μL加入到1 mL红细胞裂解液中，于冰上裂解30min，每10 min震荡一次，得到外周血悬液；

(302) 将步骤(301)得到的外周血悬液用离心机，4℃低温下1800 rpm离心3 min，弃去上清液，再加入200 μL缓冲液至剩余的沉淀中，使用微量移液器吹打沉淀使之悬起并混匀；

(303) 用离心机，4℃低温下1800 rpm离心 3 min步骤(302)的得到物，弃去上清液，再加入20 μL抗体混合溶液至剩余的沉淀中，使用微量移液器吹打沉淀使之悬起并混匀，随后将之置于冰上30 min，注意避光；

(304) 在步骤(303)得到物中加入200 μL缓冲液，混匀，随后用离心机，4℃低温下1800rpm离心3 min，弃去上清液；

(305) 在步骤(304)得到物中加入200 μL的PBS溶液，使用微量移液器将之混匀，得到流式样本溶液；

D、mo-MDSCs的检测

用步骤3的(305)得到的流式样本溶液，检测流式样本溶液中mo-MDSCs的比例，检测步骤如下：

(401)根据细胞的颗粒度和大小的普遍认知标准，使用流式细胞仪圈除流式样本溶液中的粘连细胞和死细胞，得到血液中的活单个细胞群即细胞群I；

(402)使用流式细胞仪，根据抗体CD45分子表达的情况，圈取细胞群I中PE-Cy7荧光强度大于2×10²的细胞得到细胞群II，此为血液中的白细胞群体；

(403)使用流式细胞仪，根据抗体HLA-DR的表达情况，从细胞群II中圈取抗体PE-CF594荧光强度大于2×10²的细胞得到细胞群III；

(404)使用流式细胞仪，根据抗体CD33以及抗体CD11b的表达情况，从细胞群III中圈取APC及FITC荧光强度均大于2×10²的细胞群，得到细胞群IV，此为MDSCs细胞群；

(405)检测流式样本溶液中mo-MDSCs的比例，根据抗体CD14以及抗体CD15的表达情况，从细胞群IV中圈取PE荧光强度小于2×10²且抗体APC-H7荧光强度大于3×10²的细胞群，为mo-MDSCs细胞群；

(406) 将筛选出的mo-MDSCs细胞群数量除以步骤(402)中得到的细胞群II的数量，得出外周血白细胞中mo-MDSCs的比例数值。